弱化乙醇途径关键酶活性减少酿酒酵母在丙酮酸发酵过程中副产物乙醇的积累

C4二元羧酸广泛应用于食品、医药和化工等产业。酿酒酵母被认为是生产C4二元羧酸的潜在最适微生物,但在高糖浓度及有氧条件下,它会产生大量的乙醇,对于以C4二元羧酸为目标产物来说,这会导致碳代谢流和辅助因子的损失。通过敲除PDC1和ADH1两个关键基因可同时弱化Pdc和Adh的活性,但导致菌体生长较弱。在最佳的培养基组成和培养条件下,双基因突变株的最大生物量与野生型菌株接近,发酵48 h时,最大乙醇产量为2.1 g/L,较野生型菌株最大乙醇产量下降了63.8%,此时,丙酮酸产量为2.0 g/L,而野生型菌株几乎不产丙酮酸。通过弱化乙醇途径关键酶活性可以有效减少乙醇形成,为解决利用酿酒酵母生产C4二元羧酸及其它有机酸中副产物问题提供了一个可供选择的策略。

反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定丙酮酸发酵液中丙酮酸

提出一种利用反向高效液相色谱法(RP-HPLC)测定丙酮酸发酵液中丙酮酸的方法。应用反相C18色谱柱 ODS-2 HYPERSIL 250 mm×4．6 mm 5μm,以0．05 mol·L-1NH4H2PO4(用H3PO4调pH2．6)为流动相,发酵液经稀硫酸预处理后直接进样分离定量,每一样品的分析过程不超过5 min,可及时了解丙酮酸发酵过程中丙酮酸的变化,适于发酵液中丙酮酸的检测。

酿酒酵母pdc基因缺陷菌株的构建及其丙酮酸发酵特性

丙酮酸是一种重要的有机酸,在聚合物、化妆品、食品添加剂、医药等领域具有广泛应用。酿酒酵母被认为是丙酮酸生产的潜在最适微生物,但其糖酵解过程产生的丙酮酸会在胞质内的丙酮酸脱羧酶催化作用下降解为CO2和乙醛,造成碳代谢流的损失。为将更多的碳代谢流引向丙酮酸合成,该研究通过敲除丙酮酸脱羧酶的3个结构基因(pdc1、pdc5和pdc6),显著地促进了丙酮酸积累,但也造成突变菌株XY-156生长缓慢。与进化之前相比,采用适应性进化策略驯化得到的菌株XY-156A,在细胞生长、葡萄糖消耗以及丙酮酸积累方面均获得显著提高;进一步利用2 L发酵罐进行批次补料发酵试验,发酵76 h丙酮酸产量可达105 g/L,生产强度为1.38g/(L·h),得率为0.5 g/g葡萄糖。结果表明,采用失活丙酮酸脱羧酶与适应性定向进化相结合的策略改造酿酒酵母,能够实现其高效积累丙酮酸,可为生物基丙酮酸工业化生产奠定坚实的基础。

铜绿假单胞菌厌氧胁迫丙酮酸发酵维持生存相关基因研究

为深入研究铜绿假单胞菌响应厌氧丙酮酸发酵维持长期存活相关基因,采用同源重组蔗糖反向筛选构建P. aeruginosa PAO1广谱胁迫蛋白uspK敲除株ΔPA3309,在厌氧丙酮酸发酵条件下检测野生株与敲除株表型与基因型差异。细菌存活曲线、NADH/NADPH表型差异,表明敲除株在该条件下处于高能状态、代谢速率快、存活期短;转录组差异进一步印证野生株能量代谢、信号传导基因转录低于突变株,其TetR、LysR转录调节因子下调接近220,SDR氧化还原酶下调超过215,表明野生株可能通过UspK蛋白作用转录因子,进而下调氧化还原酶等能量代谢基因的转录与表达,控制细菌适应外部厌氧胁迫环境。

乙酸渗漏型丙酮酸高产菌的选育

对Torulopsis glabrata WSH-IP303进行NTG诱变,挑选以乙酸为补充碳源的平板上透明圈较大的菌落,经初筛和复筛,发现T.glabrata WSH-LQ307生产丙酮酸能力强且稳定。以乙酸为补充碳源摇瓶培养48h,其丙酮酸产量(46.2g/L)比出发菌株(38.3g/L)提高了21％。采用该菌株在5L发酵罐上进行4批发酵实验,丙酮酸产量在64h最高可达68.7g/L,对葡萄糖的转化率为0.651g/g。

色氨酸酶重组基因表达及其酶法合成L-色氨酸

为实现色氨酸酶高效、低成本催化合成L-色氨酸,利用p ET30a为载体在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中重组表达了产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)来源的色氨酸酶,以丙酮酸、吲哚和氨为底物,探究其酶学性质,考察了反应温度、起始p H、底物摩尔比对酶促反应的影响,并利用丙酮酸发酵液为底物酶法合成L-色氨酸。结果表明,色氨酸酶重组表达成功,色氨酸酶最佳反应条件为:温度35℃,起始p H=9.0,底物摩尔比n(吲哚)∶n(丙酮酸)=0.6∶1,底物丙酮酸浓度为0.17 mol/L。利用重组色氨酸酶全细胞催化100 m L浓度为0.57 mol/L丙酮酸发酵液,流加浓度为4.27 mol/L吲哚酒精溶液6.5 m L,反应28 h后,L-色氨酸浓度达0.25 mol/L,吲哚摩尔转化率达91.8%。