应用竞争PCR检测丙酸盐对体外培养牛肝细胞丙酮酸羧化酶mRNA水平的影响

根据牛肝细胞内PC(丙酮酸羧化酶)基因组与PCcDNA相比多含有一个内含子序列,在其中再插入一外源DNA序列,从而使最终构建的突变体片段的长度大于PCcDNA的长度,成功构建了PCcDNA的竞争DNA模板,然后应用竞争PCR方法研究了丙酸盐对体外培养新生牛单层肝细胞PCmRNA水平的影响。使单层肝细胞培养液中丙酸钠浓度分别为0、1.5、2.5、3.5、4.5、8.5、11.5mmol/L,处理24h,提取总RNA、逆转录,在同一体系中用相同引物扩增目的带和竞争模板带。结果表明,随着丙酸钠浓度的升高,PCmRNA水平呈上升趋势,提示肝细胞内PCmRNA的表达水平受培养液中丙酸钠浓度的影响。

稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的克隆与分析

为揭示C4野生植物稗草(Echinochloa crusgalli)PEPCase的结构和功能特点,探索改善作物高光效新途径,克隆了稗草(E.crusgalli)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的cDNA全长,测序及同源性比较分析结果证实,稗草ppc的cDNA全长为2 886 bp,编码961个氨基酸(GenBank登录号:AY251482);核苷酸序列与谷子(Setaria italica)C3型、高粱(Sorghumbicolor)C3-2型、玉米(Zea mays)C3-2型、水稻(Oryza sativa)C3型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的同源率分别达94.8%、93.2%9、3.0%和89.7%。推导的氨基酸序列中C末端第771位氨基酸是丙氨酸(A),表明是一个C3型基因。与其他植物几种不同形式PEPCase进行的多重序列比对与系统进化分析结果也证实,此基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与所有参与对比的C3型序列的同源性均远远高于与C4型的同源性。与玉米、高粱C3-2型PEPCase的同源性分别高达96.5%9、6.4%,与高粱、玉米的C3-1型PEPCase的同源性分别为84.3%、83.8%,而与谷子、玉米、甘蔗和高粱的C4型PEPCase的一致性相对较低,分别为82.2%、79.1%、77.1%和76.6%。因此进一步推论新克隆的稗草ppc基因属于C3-2型。对其编码的蛋白序列进行了结构域、活性位点和功能位点预测。

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因高效表达载体构建及其导入小麦的研究

为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦材料,利用从玉米中克隆的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(pepc,GenBank接受号为FJ415327)构建高效双元表达载体,通过基因枪介导法将其导入小麦品种(系)中,利用Real-time PCR方法分析外源基因在转基因植株中的拷贝数。PCR和双酶切鉴定表明,玉米PEPCcDNA序列已插入双元表达载体pCAMBIA3301中,命名为p3301-pepc;对获得的抗性再生植株进行PCR扩增,其中有342株扩增出目的条带;在选取的15株转基因植株中7株拷贝数为1,3株拷贝数为2,2株拷贝数为3,拷贝数为5、8和17的分别为1株。初步证明玉米pepc基因已整合到小麦基因组中,且外源基因在转基因植株中既有单拷贝插入,也有多拷贝插入,这为进一步研究该基因在小麦基因组中的功能表达提供了试验材料。

谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)对逆境胁迫的响应

为解析谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,Phosphoenolpyruvate carboxylase)在非生物逆境胁迫下的响应特征。从谷子基因组中鉴定出一个SiPEPC(Seita.1G020700)基因,利用相关软件对其氨基酸序列、蛋白特征、功能、信号途径、顺势应答元件等参数特征进行分析和预测,随后分析了该基因在幼苗期逆境胁迫下的动态表达模式及在拔节期、抽穗期、灌浆期不同光照处理和干旱胁迫下的表达。结果表明,该基因位于谷子1号染色体,基因组序列长6 652 bp,编码965个氨基酸,基因无可变剪切、不含内含子;功能域分析显示,该基因含PEPC基因的特征结构域;多序列比对发现,该PEPC蛋白与其他植物PEPC蛋白非常相似,具有非常保守的序列结构。实时荧光定量PCR分析表明,SiPEPC(Seita.1G020700)在ABA、低温、PEG、高盐胁迫下表达量均有所上调,其中,在ABA处理时,表达量呈现波动,在12 h被诱导达到峰值。在低温处理时,表达量持续上升,在24 h达到峰值;在PEG和NaCl处理时表达量整体呈上升趋势,均在12 h达到峰值,在24 h其表达量均急剧下降。进一步研究表明,SiPEPC基因在拔节期和抽穗期正常光照强度下参与了对干旱胁迫的响应,推测SiPEPC(Seita.1G020700)基因参与了谷子对非生物逆境的应答,可能在干旱和其他逆境胁迫信号途径中起关键作用。

甘蓝型油菜三种种子储藏蛋白和丙酮酸羧化酶基因片段的克隆及hpRNA表达载体的构建

利用PCR从甘蓝型油菜(Brassica napusL.)华双4号基因组DNA中扩增出种子储藏蛋白cruc iferin、nap-in、oleosin和丙酮酸羧化酶(PEPC)基因片段,再以扩增出的片段为模板设计引物从一端扩增出4个相应的小片段,然后将同一基因的大小两个片段反向连接,插入到种子特异表达载体2300-nap多克隆位点的nap in启动子和nos终止子之间,构建成可以在油菜种子中转录表达发夹RNA(Hairp in RNA,hpRNA)结构的植物表达载体。

钝齿棒杆菌CD945丙酮酸羧化酶基因的克隆、序列分析及表达

以钝齿棒杆菌 (Corynebacteriumcrenatum)突变株CD945的基因组为模板 ,运用PCR方法 ,扩增出丙酮酸羧化酶的基因片段。核苷酸序列分析结果表明 ,该片段全长 365 7bp ,以GTG为起始密码子 ,编码一个ORF。该ORF的核酸序列与Corynebacteriumglutamicum ,Mycobacteri umsmegmatis以及Saccharomycescerevisiae的丙酮酸羧化酶结构基因相比 ,相似性分别为98 2 2 %、62 41 %和 49 61 %。由ORF推导出的氨基酸序列与上述属种的丙酮酸羧化酶相比 ,同源性分别是 99 30 %、64 65 %和 44 0 4 %。经证实对于酶的催化活性至关重要的一些保守区域 ,如ATP和生物素的结合位点等 ,在该氨基酸序列中都存在。将该基因片段转化钝齿棒杆菌 (C .crenatum)CD945 ,利用CTAB处理细胞和苹果酸脱氢酶偶联测定相结合的方法 ,进行酶活力的分析 ,结果表明 ,重组子与供体菌相比 ,丙酮酸羧化酶的活力提高

籽粒苋C_4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆和表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)是C4途径的关键酶之一。本研究克隆了双子叶植物籽粒苋(A.hypochondriacus L.)C4型PEPC基因的cDNA和gDNA全长序列。该基因编码区cDNA全长2895bp(GenBank登录号为HQ186302),编码964个氨基酸残基。对应的gDNA全长为6785bp,含10个外显子和9个内含子,内含子总长3890bp,其中第一内含子最长,为1662bp,具GATA-motif、G-box等15个光应答元件,9个激素应答元件,29个CAAT box,72个TATA box。该特征在本研究范围内的植物中,为籽粒苋所独有。比较多种植物表明,不同植物之间的C3/C4型PEPC基因的外显子长度具有较高的一致性,而内含子的长度变化较大。不同植物PEPC基因对核苷酸具有一定的选择性,并且外显子和内含子的GC含量呈正相关。总的趋势是单子叶植物外显子和内含子的GC含量均高于双子叶植物。利用半定量RT-PCR分析表达模式,发现籽粒苋PEPC基因主要在叶片中表达,表达量随光照时间延长而增加。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的分子结构研究进展

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)广泛存在于高等植物、藻类及大多数细菌中,催化C4光合作用固定CO2的第一步反应。在过去的10年中关于PEPC分子的一级结构研究已取得显著的进展,最近,通过X-射线衍射分析阐明了大肠杆菌和玉米C4型PEPC分子的三维结构,就这些研究进展进行总结。

甘蓝型油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究分析

为了解甘蓝型油菜(Brassica napus)中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的表达和分布情况,文章首先分析了油菜和拟南芥中PEPC基因之间的关系,同时参照拟南芥中4条PEPC基因扩增了针对甘蓝型油菜的探针,Southern blot结果表明,甘蓝型油菜中PEPC基因肯定多于4条,而RT-PCR分析了不同时期种子中的PEPC基因的表达情况,表明PEPC基因在种子成熟过程中油脂、储藏蛋白质等贮存物质的积累有一定作用。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的生物信息学分析

[目的]为改造磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因、提高PEPC活性寻找线索。[方法]对GenBank上登录的PEPC的cDNA序列、氨基酸序列进行BLAST搜索,运用生物信息学方法进行信号肽分析、亚细胞定位、结构域分析以及PEPC蛋白质氨基酸序列的同源性分析和系统进化树分析。[结果]共搜寻到62个PEPC蛋白质序列,绝大多数属于C3植物,9个属于C4植物。绝大多数PEPC没有存在信号肽的可能性。62个PEPC蛋白的亚细胞定位基本一致,均具有Phosphoenolpyruvate carboxylase结构域,未发现其他结构域。通过进化树分析可分别将C3植物和C4植物的PEPC酶分成4组和3组。62个PEPC蛋白质氨基酸序列的同源性为86.70%,而其在19个C3植物和9个C4植物中则分别为89.63%和89.61%。[结论]C4植物PEPC的423位上的丙氨酸和862位上的酪氨酸高度保守,而C3植物的428位和871位的氨基酸则缺少同源性,可能与C3和C4植物PEPC的活性差异有关。

丙酮酸羧化酶在胃腺癌中的表达及临床意义

目的检测丙酮酸羧化酶(PC)在胃腺癌组织中的表达并分析其临床意义。方法应用免疫组织化学方法及Westernblot法检测PC蛋白在胃腺癌及其对应癌旁组织的表达情况,分析其在肿瘤中表达水平与患者年龄、性别、TNM分期及病理分级等临床病理资料之间的关系,并用Western blot法检测PC蛋白在不同分化胃癌细胞系及永生化胃黏膜上皮细胞系的表达情况。结果免疫组化及Western blot法均显示PC在胃腺癌组织表达水平显著高于其对应癌旁组织(P<0.01)。PC高表达与患者TNM分期及病理分级显著相关(P<0.05),而与患者性别、年龄无明显相关性(P>0.05)。Western blot法显示PC在不同分化胃癌细胞系表达水平显著高于永生化胃黏膜上皮细胞(P<0.01)。结论 PC高表达与肿瘤的恶性进展密切相关,提示PC有可能作为胃癌生物治疗的潜在靶点。

丙酮酸羧化酶在结直肠癌中的表达及其生物学意义

目的:检测丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC)在结直肠癌及相应癌旁组织中的表达,并分析PC在结直肠癌发生及进展过程中可能的生物学意义.方法:首先采用免疫组织化学方法测定PC在结直肠癌及相应癌旁组织(距离肿瘤边缘5cm)中的表达水平;SPSS软件统计分析PC蛋白表达水平与结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、Dukes’分期及病理分化程度等临床病理指标之间的关系,同时分析PC蛋白表达水平与患者生存预后的关系;此外,利用R2数据库http://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/main.cgi中的大数据分析PCmRNA基因表达水平对结直肠癌患者预后的影响.结果:PC在结直肠癌组织中的表达水平高于其对应的癌旁组织(P<0.01);而且PC高表达与肿瘤浸润深度、病理分化较差及患者临床分期较高有关(P值均<0.05);此外,PC的表达与患者生存预后显著相关,PC高表达的患者预后较差(P<0.001).结论:PC在结直肠癌组织中高表达,PC与结直肠癌的发生及进展密切相关,是结直肠癌患者独立的预后因素,因此PC可作为治疗结直肠癌的潜在临床靶点.

过氧钒烟酸对糖尿病鼠磷酸烯醇型丙酮酸羧化酶的影响

用分光光度酶偶联速率法，测定用过氧钒烟酸络合物（ＰＯＶ）和二甲双胍（ＭＥＴ）治疗前后糖尿病鼠肝细胞质的磷酸烯醇型丙酮酸羧化酶（ＰＥＰＣＫ）活性。结果显示：糖尿病鼠肝细胞质的ＰＥＰＣＫ活性较正常鼠明显增加（Ｐ＜０．０１）；ＰＯＶ治疗组经ＰＯＶ治疗后该酶活性明显受抑制（Ｐ＜０．０１），而ＭＥＴ治疗组经ＭＥＴ治疗后该酶活性虽有轻微降低但无统计学意义。ＰＯＶ和ＭＥＴ对正常大鼠的ＰＥＰＣＫ均无明显影响。此结果为ＰＯＶ降低高血糖的分子生化机理提供理论依据，亦为探讨治疗糖尿病新的降糖药提供实验基础。

蓝藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的生物信息学分析

应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站对蓝藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)与其他物种进行序列同源比对,分析相同的保守序列及催化活性位点,构建分子进化树;预测跨膜结构、疏水性/亲水性、二级结构、功能域和模体等。结果显示,蓝藻PEPC与高等植物、细菌、真核藻PEPC同源性都比较低(约为33%),但是它们含有两个类似的活性部位和相同的催化活性位点;该蛋白质是非跨膜的亲水性不稳定蛋白,二级结构以a-螺旋和无规则卷曲为主,含有一个功能结构域,主要的功能是参与氨基酸的合成。

杜氏盐藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆和分析

为研究杜氏盐藻(Dunaliella salina)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)基因的功能,根据莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、花生(Arachis hypogaea)等真核生物PEPC基因高度保守序列,设计一对简并引物,通过RT-PCR的方法获得杜氏盐藻PEPC基因部分序列,然后采用RACE的方法分别克隆到5′端和3′端序列,拼接后得到全长cDNA,其长度为3 523bp,包含2 949 bp的完整开放阅读框,编码982个氨基酸,相对分子质量为110560.5。氨基酸序列与已知物种PEPC序列的同源性依次为:Chlamydomonas reinhardtii 69%,Chlorellavariabilis 55%,Ostreococcus tauri 50%和Ostreococcus lucimarinus CCE9901 49%,表明所克隆的序列确为杜氏盐藻PEPC cDNA序列。

橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因HbPPC1的克隆和表达分析

根据橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的部分序列设计引物,运用RT-PCR和RACE方法获得其家族成员的1个全长cDNA,命名为HbPPC1,长度3025bp,包含5′-UTR34bp,3′-UTR93bp,开放阅读框2898bp,编码965个氨基酸。预测HbPPC1分子量为110.34ku,理论等电点为6.09。HbPPC1具有C3型PEPC的结构特征,其N端第9-17位残基是可逆磷酸化的不变序列-X-X-SIDAQLR,C端倒数第4位残基为谷氨酰胺（Q）,第774位残基为丙氨酸（A）。HbPPC1与5条大戟科植物的PEPC序列（其中木薯2条、蓖麻2条、麻风树1条）的同源性达到95%。系统进化分析表明,HbPPC1与这5条序列聚在同一个进化支中。HbPPC1包含2个酶活性位点和7种类型的Motifs,二级结构以由α-螺旋和无规则卷曲为主。Real-timeRT-PCR结果表明,HbPPC1在橡胶树胶乳、叶片、树皮和花中均表达,在胶乳中的表达量最高;胶乳HbPPC1的表达受乙烯利刺激影响,在乙烯利刺激4-72h后胶乳HbPPC1表达明显下调,表明HbPPC1在胶乳pH值调控中起重要作用。本研究结果为HbPPC1的功能研究提供理论依据。

小麦导入磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的初步研究

[目的]将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因导入普通小麦临优145。[方法]利用根癌农杆菌遗传转化系统,以普通小麦临优145为材料,将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因,导入小麦胚性愈伤组织中,用含潮霉素(hyg)的筛选培养基连续筛选,并从分子水平上检测该基因。[结果]获得了hyg抗性植株,经GUS组织化学染色检测表明,抗性苗叶片被染成了深蓝色;PCR检测出目标条带。[结论]初步证明磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因已经导入受体材料中。

甘蔗C_4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因植物表达载体构建

根据用于转化的甘蔗 C4Ppc基因的特点 ,分别构建了无启动子、35 S启动子、2 x35 S启动子的植物表达载体 p BIpepc、p L Apepc、p CBIpepc;用盐冻融法将其导入农杆菌 LBA4 40 4 ,可用于烟草、水稻、大豆、甘薯等 C3 作物遗传转化。

丙酮酸羧化酶及其在肿瘤代谢中的研究进展

正常细胞在有氧条件下葡萄糖进入三羧酸循环(tricar-boxylic acid cycle,TCA)完成有氧氧化过程,在此过程中生成腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)提供能量,同时生成大量中间产物,为生物大分子如核苷酸、脂肪酸及氨基酸的合成提供重要的中间产物;而在无氧条件下则更多地促使葡萄糖进入糖酵解途径氧化供能。但在肿瘤细胞中,无论是有氧条件还是无氧条件,葡萄糖都主要进入糖酵解途径,这一代谢特点称为沃伯格效应(Warburg effect)[1]。此时,若进入TCA的丙酮酸不足,则影响生物大分子的合成,无法维持肿瘤细胞的生存和快速增殖。

除莠霉素A对稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的影响

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ＰＥＰＣ）是Ｃ４植物的光合关键酶，１００ｍｇ／Ｌ除莠霉素Ａ对ＰＥＰＣ活性有完全的抑制作用，而对Ｃ３植物的光合关键酶１，５－二磷酸核酮糖羧化酶（ＲｕｂｉｓＣＯ）的活性却没有影响。