薏苡丙酮酸脱羧酶1(PDC1)基因片段cDNA克隆与分析

参考水稻、玉米的PDC1蛋白保守序列以及甘蔗的PDC基因片段,设计1对简并引物,从薏苡中克隆了PDC基因片段。经测序和在NCBI数据库进行序列相似性搜索,结果表明,该序列与甘蔗PDC基因同源性为96%,与玉米PDC3和水稻PDC2同源性分别为94%和90%,推测该序列为薏苡PDC1基因片段。

水稻丙酮酸脱羧酶基因OsPDC3功能的初步研究

植物花粉中存在着活跃的有氧发酵过程。丙酮酸脱羧酶(PDC)作为发酵途径中的关键酶,参与花粉中的能量和物质代谢,在花粉萌发过程中起重要作用。通过反向遗传学的方法对水稻丙酮酸脱羧酶基因OsPDC3的功能进行了初步分析。OsPDC3是一个单外显子基因,编码蛋白与另外4个水稻PDC蛋白间的序列一致性达到77%～82%。表达模式分析显示OsPDC3在花粉中特异表达,GUS组织染色进一步证实其启动子具有花粉特异表达活性。超量表达OsPDC3会使转基因植株叶片中的PDC酶活性上升,表明OsPDC3在体内具有活性功能,能够参与花粉内的生理活动。反义抑制下调了OsPDC3在花粉中的表达水平,但对花粉的离体萌发率没有产生影响,推测这是由于PDC基因间的冗余造成的。

Cre-loxP重组酶技术敲除酿酒酵母丙酮酸脱羧酶编码基因pdc1和pdc5

目的:分别构建含有酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因pdc1和pdc5同源序列loxP-kanMX-loxP的质粒,敲除丙酮酸脱羧酶基因。方法:以两端含40 bp pdc1或pdc5的同源序列为引物,以pUG6质粒DNA为模板,通过PCR扩增loxP-kanMX-loxP基因敲除片段,将其分别插入pMD18-T、pEASY-T3,构建表达载体pTWCL-PDC1与pTWCL-PDC5并测序,构建后的质粒利用醋酸锂转化法转化酿酒酵母H5,经筛选鉴定后进行摇瓶发酵试验。结果:分别含有1693、1672 bp目的片段pdc1-loxP-kanMX、pdc5-loxP-kanMX的质粒pTWCL-PDC1与pTWCL-PDC5构建成功,发酵试验显示重组酿酒酵母H5-01与H5-02较原始菌株的乙醇产量分别下降了14.53%与17.54%,证明pdc1或pdc5基因被敲除。结论:利用Cre-loxP重组酶技术分别敲除了酿酒酵母pdc1和pdc5基因,为后续在酿酒酵母中连续敲除pdc1和pdc5奠定了良好的技术基础。

单倍体酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因(pdc1)的敲除与鉴定

为了抑制单倍体酿酒酵母H14的副产物乙醇的合成,使得2,3-丁二醇产量的提升。利用基因工程手段构建载体pWCL-pdc1,获得两端含40 bp pdc1的同源重组片段-loxP-kanMX-loxP。利用Cre/loxP技术获得pdc1缺失菌株S.cerevisiae H14-01(△pdc1)。并以野生型菌株S.cerevisiae H14为对照,进行摇瓶发酵试验。S.cerevisiae H14-01长势明显略低于原始菌株。在整个发酵期间,2,3-丁二醇的最高产量和转化率分别为0.373±0.016 g/L和0.005 g/g,分别较原始菌株提高了37.30%和4.66%,但原始菌株没有检测到乙偶姻和2,3-BD生成。另外S.cerevisiae H14-01的乙醇转化率降低了33.24%,但甘油产量提高了15.76%。说明了碳流流向乙醇被阻断之后,会增加2,3-丁二醇的产量,同时会使此部分碳流流向甘油。因此,并为进一步获得高产2,3-丁二醇的工程微生物群体奠定了基础。

编码酿酒酵母丙酮酸脱羧酶(Pdc6)基因克隆及其生物信息学分析

旨在从生物信息学角度更好地研究酿酒酵母丙酮酸脱羧酶(Pdc6)的结构和功能,克隆酿酒酵母H5的丙酮酸脱羧酶基因pdc6。利用Primer 5.0软件设计1对20 bp引物,以H5基因组DNA为模板克隆获得pdc6,并利用生物信息学分析方法对其序列进行验证及分析。该序列长度为1692 bp,无碱基缺失,且该基因具有完整的开放阅读框,该基因编码的Pdc6包含563个氨基酸残基,该蛋白质中酸性氨基酸残基数量和碱性氨基酸残基数量大致相同;Pdc6理论等电点5.8,疏水性最大值为2.32,亚细胞定位预测其位于细胞外基质,属于酸性蛋白质,并预测了空间结构模型。本研究说明该蛋白结构与Pdc1和Pdc5结构类似,对酿酒酵母H5编码丙酮酸脱羧酶(Pdc6)基因序列克隆和生物信息学分析后,可为后续单基因敲除选取基因顺序的研究提供一定的理论基础。

酿酒酵母丙酮酸脱羧酶活性测定的研究

丙酮酸脱羧酶是酿酒酵母代谢中非常关键的酶,其催化的反应是利用丙酮酸生成乙醛。研究构建了一种分光光度法测定酿酒酵母中丙酮酸脱羧酶活性的方法,在25℃和pH6.0的条件下测定反应液5min内在波长340nm处每分钟吸光度值的变化。以在25℃和pH6.0的条件下每分钟转化1.0μmol丙酮酸生成乙醛来定义酶的活性。

运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

以总DNA为模板,采用PCR技术克隆得到运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase)基因pdc,将该基因连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSE-pdc.将此重组质粒转化到受体菌E.coliDH5α中,挑取重组菌株.经IPTG诱导后,在乙醛指示平板检测到丙酮酸脱羧酶活性.SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异性蛋白质条带:其分子量约为60KD.

酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达

目的酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)丙酮酸脱羧酶 (PDC)基因的克隆和表达。方法利用PCR技术从酿酒酵母的总cDNA中钓取出PDCsc基因 ,构建其高效表达质粒 ,利用Ion和ompT蛋白酶缺陷株EscherichiacoliBL2 1 (DE3)进行表达。结果扩增出长约 1 7kb的PDCsc基因 ,成功构建其表达质粒pSC -2 2b ,对转化菌株的SDS -PAGE分析结果显示 :该基因获得高效表达 ,表达蛋白占细胞总蛋白的 1 8 6 %。结论成功构建高效表达PDCsc基因的工程菌株 。

丙酮酸脱羧酶及其在手性合成中的应用

主要介绍了酿酒酵母和移动单孢中丙酮酸脱羧酶的结构、性质及其在手性合成中的应用 ,包括反应的机理。

丙酮酸脱羧酶的催化机制及应用研究进展

综述了丙酮酸脱羧酶的结构及催化机理,并介绍了其在酒精生产、药物合成和有机合成方面的应用。

新型胺基化PVC膜丙酮酸脱羧酶传感器的研究

木文报道了基于固定丙酮酸脱羧酶于胺基化PVC膜上测定两酮酸盐的新的生物传感器。接上由新鲜玉米脐提取的丙酮酸脱羧酶的传感器具有响应速度快、使用寿命较长且无需外加丙酮酸盐脱羧酶辅助因子。

丙酮酸脱羧酶催化合成L-苯基乙酰基甲醇的研究

用酵母的丙酮酸脱羧酶粗提物催化苯甲醛合成Ｌ－苯基乙酰基甲醇（Ｌ－ＰＡＣ），后者为合成Ｌ－麻黄素的前体。酶转化反应的最佳温度为１０℃，ｐＨ６．８，时间为５～６ｈ，酶用量７ｕ／ｍｌ，乙醇２．０ｍｏｌ／Ｌ，苯甲醛１５０～１８０ｍｍｏｌ／Ｌ，丙酮酸１５０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ，转化液中Ｌ－ＰＡＣ浓度可达１４０ｍｍｏｌ／Ｌ。

丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因表达载体的构建

以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的总DNA为模板,PCR扩增运动发酵单胞菌中的丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因和乙醇脱氢酶Ⅱ(Alcohol dehydrogenaseⅡ,ADHⅡ)基因。将丙酮酸脱羧酶基因和含核糖体结合位点(RBS)的乙醇脱氢酶基因串联起来置于T7启动子控制下,构成多顺反子表达质粒pQR-PRA。经酶切和PCR验证,表达载体构建成功。将pQR-PRA转入大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21中,转化子的定性检测表明有酶表达,并且初步测定了2种酶的表达量。

移动单孢菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达

目的克隆与表达移动单孢菌(Zymomonas mobilis)丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因。方法利用聚合酶链反应(PCR)技术从移动单孢的基因组DNA中扩增出PDCzm基因,构建其高效表达质粒,利用Ion和ompT蛋白酶缺陷株Escherichia coli BL21(DE3)进行表达。结果扩增出DNA碱基对数目约1.7 kb的PDCzm基因,成功构建其表达质粒pZM 22 b,对转化菌株的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析结果显示:该基因获得高效表达,表达蛋白占细胞总蛋白的37.9%。结论成功构建高效表达PDCzm基因的工程菌株,为实现利用PDCzm进行的生物转化奠定了基础。

烟草丙酮酸脱羧酶家族生物信学分析

为研究烟草丙酮酸脱羧酶家族特性,运用ProtScale、CDD、Interpro、Muscle、phyml和TreeDyn等工具分析烟草丙酮酸脱羧酶家族各成员的亲疏水性、结构域和进化树。结果表明:NtPDC_1和NtPDC_2具有亲水性,属于可溶性蛋白,NtPDC_3,NtPDC_4,NtPDC_5和NtPDC_6具有疏水性,为非可溶性蛋白;烟草丙酮酸脱羧酶属于硫胺素焦磷酸(TPP)依赖性酶超家族,各成员均含有3组结构域,分别为N-末端TPP结构域、中心域和C-末端TPP结构域;烟草、拟南芥、水稻、薏苡和玉米的丙酮酸脱羧酶聚类为4组,其中烟草丙酮酸脱羧酶主要聚集在Ⅰ组和Ⅱ组,其进化相对保守。

烟草丙酮酸脱羧酶的生物信息学分析

为进一步了解烟草丙酮酸脱羧酶的特性及功能,采用NetPhos 3.1 Server、Meme和Wolf Psort工具获取烟草丙酮酸脱羧酶的磷酸化位点、保守基序和亚细胞定位的相关信息并进行分析。结果表明:丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点数以NtPDC_1成员较多,酪氨酸磷酸化位点数以以NtPDC_3成员较多;烟草丙酮酸脱羧酶成员中共检测到7组保守基序,以Motif 1~6较为保守,NtPDC_6缺失Motif 7,除Motif 5外,其他他保守基序均作为序列功能结构域的重要组成部分;NtPDC_1、NtPDC_2和NtPDC_3定位于细胞质,NtPDC_4定位于线粒体,NtPDC_5和NtPDC_6定位于内质网。

酿酒酵母pdc基因缺陷菌株的构建及其丙酮酸发酵特性

丙酮酸是一种重要的有机酸,在聚合物、化妆品、食品添加剂、医药等领域具有广泛应用。酿酒酵母被认为是丙酮酸生产的潜在最适微生物,但其糖酵解过程产生的丙酮酸会在胞质内的丙酮酸脱羧酶催化作用下降解为CO2和乙醛,造成碳代谢流的损失。为将更多的碳代谢流引向丙酮酸合成,该研究通过敲除丙酮酸脱羧酶的3个结构基因(pdc1、pdc5和pdc6),显著地促进了丙酮酸积累,但也造成突变菌株XY-156生长缓慢。与进化之前相比,采用适应性进化策略驯化得到的菌株XY-156A,在细胞生长、葡萄糖消耗以及丙酮酸积累方面均获得显著提高;进一步利用2 L发酵罐进行批次补料发酵试验,发酵76 h丙酮酸产量可达105 g/L,生产强度为1.38g/(L·h),得率为0.5 g/g葡萄糖。结果表明,采用失活丙酮酸脱羧酶与适应性定向进化相结合的策略改造酿酒酵母,能够实现其高效积累丙酮酸,可为生物基丙酮酸工业化生产奠定坚实的基础。

乙酸渗漏型丙酮酸高产菌的选育

对Torulopsis glabrata WSH-IP303进行NTG诱变,挑选以乙酸为补充碳源的平板上透明圈较大的菌落,经初筛和复筛,发现T.glabrata WSH-LQ307生产丙酮酸能力强且稳定。以乙酸为补充碳源摇瓶培养48h,其丙酮酸产量(46.2g/L)比出发菌株(38.3g/L)提高了21％。采用该菌株在5L发酵罐上进行4批发酵实验,丙酮酸产量在64h最高可达68.7g/L,对葡萄糖的转化率为0.651g/g。

弱化乙醇途径关键酶活性减少酿酒酵母在丙酮酸发酵过程中副产物乙醇的积累

C4二元羧酸广泛应用于食品、医药和化工等产业。酿酒酵母被认为是生产C4二元羧酸的潜在最适微生物,但在高糖浓度及有氧条件下,它会产生大量的乙醇,对于以C4二元羧酸为目标产物来说,这会导致碳代谢流和辅助因子的损失。通过敲除PDC1和ADH1两个关键基因可同时弱化Pdc和Adh的活性,但导致菌体生长较弱。在最佳的培养基组成和培养条件下,双基因突变株的最大生物量与野生型菌株接近,发酵48 h时,最大乙醇产量为2.1 g/L,较野生型菌株最大乙醇产量下降了63.8%,此时,丙酮酸产量为2.0 g/L,而野生型菌株几乎不产丙酮酸。通过弱化乙醇途径关键酶活性可以有效减少乙醇形成,为解决利用酿酒酵母生产C4二元羧酸及其它有机酸中副产物问题提供了一个可供选择的策略。

一种基于途径分析提高丙酮酸产量的育种策略

为进一步提高光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的水平 ,在途径分析的基础上提出了一种组成型降低丙酮酸脱酸酶、但增强乙酰辅酶A合成酶活性的育种策略。通过亚硝基胍诱变 ,获得 1株乙酸需求型突变株CCTCCM2 0 2 0 19,在外加乙酸的培养基中表现出高于出发株 2 1%的丙酮酸生产能力和良好的遗传稳定性。检测突变株CCTCCM2 0 2 0 19中丙酮酸代谢相关酶的活性发现 :(1)丙酮酸脱羧酶活性降低了 4 0 % ;(2 )外加乙酸与否的条件下 ,乙酰辅酶A合成酶的活性分别提高了 10 3 5 %和 5 7 4 % ;(3)添加乙酸和突变对丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶系、乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性没有显著影响。在含有乙酸的培养基中突变株细胞干重比出发株高 2 1 7% ,可能是因为乙酰辅酶A合成酶活性的提高 ,补充了因丙酮酸脱羧酶活性降低而引起的胞质乙酰辅酶A短缺。在 7L罐中含有 6g L乙酸钠的培养基中发酵 6 2h ,丙酮酸产量达到 6 8 7g L ,对葡萄糖的产率为 0 6 5 1g g。