基因工程丙酰螺旋霉素

以碳霉素４″异戊酰基转移酶基因（ｃａｒＥ）为探针，从麦迪霉素产生菌基因文库中，经菌落杂交获得阳性菌落ｐｃＮ１０Ｆ５。经分子杂交证明ｐｃＮ１０Ｆ５ＤＮＡ的ＢａｍＨ１－ＢａｍＨＩ８．０ｋｂ片段与ＣａｒＥ基因同源。将ｐＣＮ１０Ｆ５ＢａｍＨＩ－ＢａｍＨ１８．０ｋｂ片段分别克隆到ｐＩＪ６８０、ｐＷＨＭ３、ｐＷＨＭ６０１质粒载体上，获得重组质粒ｐ６Ｆｓ、ｐｗＦ５和ＰＧＦ５。含上述重组质粒的螺旋霉素产生菌克隆菌株均产生与丙酰螺旋霉素相类似的产物，且以ｐＩＪ６８０为载体的克隆菌株产生丙酰螺旋霉素的比例最高，最稳定。含ｐ６Ｆ５克隆菌株的发酵产物经提取、纯化后，进行理化性质及各种光谱数据的分析，证明其主要产物为丙酰螺旋霉素Ⅲ及Ⅱ。分子杂交实验证明螺旋霉素产生菌克隆菌株中，确实含有ｐ６Ｆ５ＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ８．０ｋｂ片段。经分子杂交、亚克隆及基因表达实验，将麦迪霉素４″羟基丙酰基转移酶基因，定位于ＥｃｏＲＩ－ＥｃｏＲＩ－ｐｓｔＩ的２．６ｓｋｂ片段上。核昔酸序列分析结果显示该基因由１１６４个核昔酸组成，Ｇ＋Ｃ％为７０．ｏ％，ＳＤ序列为ＧＡＧＧＴ，起始密码为ＡＴＧ，终止密码为ＴＧＡ，共编码３８８个氨基酸残基，蛋白的分子量为４２．?

用双水相萃取丙酰螺旋霉素的研究

用双水相萃取（ＡＴＰＥ）丙酰螺旋霉素（ＰＲＯ－ＳＰＭ），分别用ＰＲＯ－ＳＰＭ溶液和发酵液，对聚乙二醇（ＰＥＧ）和磷酸盐成相系统进行了研究，选出了合适的成相系统。在研究中发现ＰＲＯ－ＳＰＭ对成相有一定的影响。根据数据提出在ＰＲＯ－ＳＰＭ的双水相萃取过程中疏水作用是影响萃取的主要因素，与蛋白质以静电效应为主不同。用发酵液进行放大试验并与溶媒法进行比较，ＡＴＰＥ法萃取收率提高了３２％，而纯度有所下降。初步探讨了聚合物的重复使用。

全发酵液萃取丙酰螺旋霉素的研究

利用双水相技术，并与有机溶剂萃取技术结合，于ｐＨ８．０～８．５，采用１４％聚乙二醇２０００－１８％Ｎａ２ＨＰＯ４系统，建立了丙酰螺旋霉素的全发酵液萃取新工艺。小试收率达到６９．２％，对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为５３．４％。

丙酰螺旋霉素基因工程菌构建的研究

将含有丙酰化酶基因的pIJM9重组质粒转化至螺旋霉素生产菌株S.spiramyceticus获得的转化子,经菌落原位杂交和Southern分子杂交表明,No.61转化子含有pIJM9重组质粒,其发酵产物经薄层层析,生物显迹试验证明,含有与丙酰螺旋霉素标准品Rf值相类似的组分,高压液相色谱分析也证明其产物中有与丙酰螺旋霉素保留时间基本一致的成份,质谱分析结果表明产物中含有与丙酰螺旋霉素Ⅱ相同的组分,这说明No.61克隆菌株是能够直接产生丙酰螺旋霉素的基因工程菌。

螺旋霉素和丙酰螺旋霉素的某些萃取性质的比较研究

研究了溶剂萃取和反萃取丙酰螺旋霉素的有关性质，并与螺旋霉素作了比较。根据螺旋霉素及丙酰螺旋霉素的表观分配常数与ｐＨ的模型式，用高斯牛顿法回归理论分配系数分别为３３．６２和１９．０１，并通过回归首次得到丙酰螺旋霉素的解离常数为７．７６和５．２。通过在磷酸盐缓冲液体系中的反萃取实验得到反萃取的经验模型为Ｋ＋ａ＝ｂ＋ｃ＊ｐＨ，通过计算可知当ｐＨ为３．１５和３．２４时，丙酰螺旋霉素和ＳＰＭ反萃取率达到最大，分别为４８和１０２。另外还研究了温度对萃取和反萃取的影响。根据所得公式可以得到丙酰螺旋霉素的计算诺模图。

丙酰螺旋霉素I的分离与鉴别

用大孔吸附树脂等方法分离丙酰螺旋霉素（ＰｒｏＳＰＭ），除得到以前分离的丙酰螺旋霉素ＩＩＩ（ＰｒｏＳＰＭＩＩ）外，又得到一个新成分。根据其理化性质和波谱［ＵＶ，ＨＲＭＳ，１ＨＮＭＲ，１３ＣＮＭＲ（含ＤＥＰＴ）和１Ｈ１３ＣＣＯＳＹ］数据，并与ＰｒｏＳＰＭＩＩ比较，ＰｒｏＳＰＭＩＩ仅Ｃ３酰基不同，命名为丙酰螺旋霉素ＩＩ（ＰｒｏＳＰＭＩＩ）。

丙酰螺旋霉素的药理研究

丙酰螺旋霉素(Pro-SPM)为一抗革兰氏阳性球菌为主的新抗生素,体内外药效优于乙酰螺旋霉素(Ac-SPM),急性毒性较小,小鼠LD_(50)口服为3700mg/kg,静脉为354.96mg/kg,大鼠LD_(50)口服为4000mg/kg。Pro-SPM 30mg/kg静脉注射对兔心电图、呼吸无影响,仅引起轻度血压下降。Pro-SPM在兔体内的代谢与Ac-SPM相似,均转变成螺旋霉素,药动学参数提示Pro-SPM的体内代谢慢于Ac-SPM,Pro-SPM的达峰浓度(Cmax)、曲线下面积(AUC)均高于Ac-SPM。兔口服Pro-SPM、Ac-SPM后24小时回收率分别为5.52%、5.25%。Pro-SPM的Ames试验、染色体畸变试验结果均为阴性。

高压液相色谱法测定血尿中丙酰螺旋霉素

丙酰螺旋霉素(Pro—SPM)是药生所利用酶工程定向酰化螺旋霉素(SPM)得到的一种新的十六碳大环内酯类抗生素,体内外抗菌活性优于临床目前使用的乙酰螺旋霉素(Ac—SPM)。本文选用μ—Bonadapack C_(18)柱,以甲醇—磷酸(PH2.8)(33:67)为流动相,较好地分离了兔血尿中Pro—SPM、Ac—SPM和SPM,并用单组份标准品建立了高压液相色谱法(HPLC)测定免血尿中Pro一SPM、Ac—SPM和SPM浓度的标准曲线,线性范围为0.1～8μg/ml。

生技霉素小组分的研究 Ⅱ.生技霉素A_0、B_3和C_2的结构鉴定

生技霉素中除了主要组分 4 " -异戊酰螺旋霉素 、 、 (生技霉素 A1 、B1 、E1 )和小组分 4 " -丁酰/异丁酰螺旋霉素 (生技霉素 A2α/ A2β)以外 ,还含有其它 4 " -酰化螺旋霉素和少量杂质。经过 U V、IR、SI-MS、1 H- NMR、1 3C- NMR、1 H- 1 H COSY等光谱分析 ,并与生技霉素已知组分的光谱数据进行对照 ,确定了生技霉素 A0 为普拉特霉素 A1 ,生技霉素 B3为 4 " -丙酰螺旋霉素 ,生技霉素 C2 为 4 " -丙酰螺旋霉素 ,并对各组分所有碳氢信号的化学位移作出了明确的归属。