东亚三角涡虫cDNA文库的构建及EST初步分析

为了快速高效地分离鉴定东亚三角涡虫的发育和再生相关基因,以总RNA为模板,借助CreatorTM SMAR-TTM cDNA Library Construction Kit和Advantage 2 PCR Kit成功构建了东亚三角涡虫的cDNA文库。经测定,cDNA文库原始库容为1.22×105个独立克隆,重组率超过98%,插入片段平均大小为900bp。从文库中随机挑选重组克隆测序,并在NCBI数据库中比对,结果获得208个rRNA基因,148个编码蛋白基因,78个染色体片段基因。该研究为我国涡虫发育和再生的深入研究奠定了坚实的分子基础。

铜对东亚三角涡虫运动和再生的影响(英文)

[目的]研究铜对涡虫运动和再生的影响。[方法]用不同浓度的铜溶液处理涡虫,分别进行了4和6d的培养试验,并设置空白对照组。[结果]成体涡虫24,48,72和96h运动的半抑制浓度(mIC50)分别为3.86,3.73,3.47和2.61mgCu2+/L。幼虫24,48,72和96h运动的半抑制浓度(mIC50)分别为2.22,1.64,0.87和0.93mgCu2+/L。整体呈现出浓度效应关系。涡虫6d的眼点和耳突再生的半抑制浓度分别是0.76,0.78mgCu2+/L。呈现出浓度效应关系。[结论]支持涡虫作为水生生态系统的指示生物。

N,N二甲基甲酰胺对东亚三角涡虫的毒性效应

目的研究水体中二甲基甲酰胺(DMF)对东亚三角涡虫的毒性作用。方法急性毒性实验检测DMF对涡虫形态、死亡率的影响;抗氧化酶活力测定实验检测DMF对涡虫体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力的影响;彗星实验检测DMF对涡虫DNA的损伤。结果随着DMF浓度的增加和暴露时间的延长,涡虫的死亡率呈现上升趋势;浓度高于0.1%的DMF可以抑制涡虫头部再生;DMF在0%～0.5%之间时,涡虫SOD酶活力呈"钟型"分布;0.2%～0.4%的DMF诱导CAT活力增加;但DMF对涡虫体内GSH-PX的作用规律不明显;1%的DMF对涡虫DNA有一定的损伤作用。结论 DMF对东亚三角涡虫具有明显的毒性作用;同时涡虫对DMF反应敏感,在检测水体DMF污染方面有一定的应用前景。

N,N-二甲基乙酰胺对东亚三角涡虫(Dugesia japonica)毒性效应的研究

N,N-二甲基乙酰胺(DMA)的大量应用导致其越来越多的进入环境,然而水环境中的DMA对水生生物的毒性尚不明确.通过急毒性、再生、抗氧化酶活力及彗星电泳试验,探讨DMA对东亚三角涡虫(Dugesia japonica)的毒性作用.研究发现,DMA处理涡虫24、48、72、96h的半致死浓度(LC50)分别为27.7、18.4、10.7、6.7g/L;浓度大于0.9g/L的DMA会损伤再生组织,延缓涡虫完成再生;处理48h后,DMA浓度为0～5g/L时,涡虫体内过氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力呈上升趋势,大于5g/L时酶活力开始下降,而过氧化氢酶(CAT)活力在DMA浓度小于1g/L时呈下降趋势,大于1g/L后呈现上升趋势;DMA对涡虫DNA的损伤作用不明显,浓度达到10g/L后才表现出遗传毒性(P<0.05).结果表明DMA对涡虫有明显的生物毒性,同时涡虫对DMA毒性的反应灵敏,可用于监测水环境DMA污染.

东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry的表达和酶活分析

通过对东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry氨基酸序列比对分析,发现保守的催化三联体结构中第一位的His被Lys所取代。为了探究这种突变是否会对胰蛋白酶的活性有影响,文章构建了原核表达重组质粒pET-28a-Djtry,转化到E.coli BL21中,利用IPTG诱导表达,对表达的重组蛋白进行变性、复性、纯化以及Westernblotting鉴定,获得成分均一的活性蛋白。利用牛胰蛋白酶为标准品,胰蛋白酶特异性底物BAEE,检测Djtry酶活力与比活力。SDS-PAGE电泳表明诱导表达的融合蛋白为包涵体,分子量约为26 kDa,Western blotting结果显示为目的蛋白,对复性纯化的目的蛋白进行酶活检测发现,突变型胰蛋白酶Djtry仍然保持了胰蛋白酶催化性质,但是催化活性相对较弱。

东亚三角涡虫DjWnt5a克隆及在胚胎不同发育阶段中的表达

WNT(wingless-type MMTV integration site family)蛋白是一类分泌性糖蛋白家族,Wnt5a为非经典Wnt蛋白的典型代表,在各种器官的发育中发挥重要作用。为了探索东亚三角涡虫Dj Wnt5a基因在涡虫胚胎不同发育阶段中的表达和功能,利用RT-PCR(reverse transcription PCR)和RACE(rapid-amplification of c DNA ends)技术克隆并分析了Dj Wnt5a c DNA的表达。结果表明,Dj Wnt5a基因由1 523 bp组成,编码371个氨基酸,其中含有23个保守的半胱氨酸结构域。利用MAGE 5.2构建进化树分析发现,东亚三角涡虫与地中海涡虫的Wnt5a聚群,并位于两侧对称动物的基部,可能是Wnt5a的原始类型。利用整体原位杂交技术分析Dj Wnt5a基因的表达,结果显示,Dj Wnt5a基因在涡虫发育的第三阶段开始表达,主要集中在胚胎咽及胚带;随着胚胎发育直至完全孵化出幼虫,Dj Wnt5a基因逐步在神经原基和中枢神经系统表达。由此推断,东亚三角涡虫Dj Wnt5a基因在涡虫胚胎发育时,参与神经原基的形成和分化,是涡虫胚胎神经发育必不可少的基因之一。

东亚三角涡虫Djtraf3基因的时空表达模式

肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)作为TRAF家族的成员之一,通过介导TLRs信号通路,参与动物的免疫反应。通过构建东亚三角涡虫Djtraf3的cDNA文库获得Djtraf3基因并分析基因结构。结果发现,该最大开放阅读框为564bp,编码的蛋白质含187个氨基酸,含有1个TRAF结构域。进化分析表明,DjTRAF3和果蝇的TRAF3聚群,位于进化树的基部;整体原位杂交结果显示,在涡虫成体及不同再生阶段,Djtraf3在整个肠部表达。这些结果为进一步探究其功能提供了依据和方向。

东亚三角涡虫新基因Dj_UF-1功能分析

为进一步完善东亚三角涡虫(Dujesia japonica)基因数据信息,对东亚三角涡虫新基因Dj_UF-1进行生物信息学分析和表达水平检测.分析结果显示,该基因包含450bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,Dj_UF-1蛋白分子量为17 179.8D,等电点为8.03.蛋白质三级结构预测发现Dj_UF-1与LYNX 1相似度较高.实时定量PCR结果表明,Dj_UF-1基因在东亚三角涡虫头部的表达量高于其在尾部的表达量.推测Dj_UF-1基因是东亚三角涡虫神经系统相关基因,Dj_UF-1为类LYNX 1蛋白.

东亚三角涡虫监测水体重金属污染的可行性研究

随着现代工、农业的快速发展,水体重金属污染已成为全球性的环境问题。对水体重金属污染的现状、来源、危害以及监测方法进行了介绍,并探讨了生物监测技术的优越性。在前人的研究基础上,结合本实验室工作,提出利用东亚三角涡虫（Dugesiaojapoice）作为水体重金属污染监测指示生物的可行性,并对更为灵敏的生物标志物的策略和实验方案进行了展望。

东亚三角涡虫PSA蛋白的表达、鉴定及抑菌分析

PCR扩增含酶切位点的DjPsa基因(ORF),构建了DjPsa基因的原核表达载体pET-28a(+)-DjPsa,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE、Western blotting(His-Tag抗体)分析表达蛋白,抑菌试验检测其活性。结果表明,重组质粒在E.coli BL21(DE3)中以包涵体的形式高效表达,其蛋白的分子大小约为25 kD;Western blotting检测说明得到的蛋白为PSA重组蛋白;抑菌试验显示复性后的PSA具有较强的抑菌作用,为进一步研究它的功能、活性提供基础。

PFOS对再生东亚三角涡虫抗氧化酶活性的影响

为了探究全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate,PFOS)对再生涡虫抗氧化酶活性的影响,以再生中的涡虫作为实验材料,采用酶活性的测定的方法来探究PFOS对再生中东亚三角涡虫中抗氧化酶活性的影响。结果表明,PFOS刺激涡虫产生应激反应。在再生早期,PFOS胁迫会造成涡虫的氧化损伤和脂质的过氧化,并表现出随着PFOS浓度的升高,涡虫氧化损伤程度加剧的趋势;再生5 d时,机体产生抗氧化的反应来消除体内的氧自由基;在再生的后期,由于涡虫对药物的耐受作用,涡虫的抗氧化反应不显著。

东亚三角涡虫DjPLCβ4基因克隆及在胚胎发育中的组织特异性表达

磷脂酶C的β亚型(PLCβ)在突触传递和可塑性的调节中发挥着重要作用。东亚三角涡虫Dugesia japonica作为首次出现三胚层的两侧对称动物,是研究发育和进化的重要模式生物。为了研究DjPLCβ4基因在东亚三角涡虫胚胎发育不同阶段的表达,通过RT-PCR和RACE技术克隆并验证了DjPLCβ4 cDNA的功能与表达图谱。结果显示,DjPLCβ4基因全长3245 bp,编码969个氨基酸。系统进化树显示,东亚三角涡虫与其他物种的PLCβ4亚型聚群,并位于两侧对称动物的基部,可能是PLCβ4的原始类型。通过整体原位杂交技术研究DjPLCβ4基因在胚胎中的时空表达,DjPLCβ4基因最开始表达于胚胎发育的第3阶段,阳性信号主要位于胚胎咽及胚带;随着发育,胚胎孵化出幼虫,DjPLCβ4基因主要表达于神经原基和中枢神经系统。综上所述,东亚三角涡虫DjPLCβ4基因参与胚胎神经原基的形成和分化。

DjRock2参与东亚三角涡虫再生调节

利用体外转录的方法合成DjRock2基因的RNA探针,检测RNA探针效率后,对成体及再生过程中的涡虫进行原位杂交试验;将DjRock2基因插入到L4440载体中,构建L4440-DjRock2干扰载体,合成dsRNA并微注射涡虫,利用RT-PCR和Western blot技术检测干扰后再生过程中DjRock2 mRNA和蛋白表达的下调作用。结果表明:DjRock2基因在成熟涡虫中枢神经系统中特异性表达,再生过程中伤口处胚基位置有阳性信号;干扰成体涡虫在再生第3天,头部、中部、尾部都有胚基的形成,但是第5天开始伤口处细胞凋亡,成体干细胞没有完成正常的分化,头部、中部、尾部再生都受到抑制,不能正常完成再生,甚至死亡。RT-PCR技术检测到RNA干扰后DjRock2mRNA的表达显著下降。Western blot检测到干扰后DjRock2蛋白的表达下调。所构建的L4440-DjRock2干扰载体干扰效率高,表型变化明显,从基因和蛋白方面进行分析,为进一步研究Rock2基因的功能奠定了基础。

鲁中山区东亚三角头涡虫有性生殖过程研究初报

于2005年3-5月、9～11月对生活于鲁中山区的东亚三角头涡虫（Dugesia japonica）的有性生殖过程进行了研究，发现鲁中山区东亚三角头涡虫1年只有1次有性生殖过程。卵囊产出的高峰在4月，卵囊孵化与种群密度最高峰在5月，其有性生殖过程与温度、食物、虫体大小密切相关。经实验观察1个卵囊最多能孵出涡虫幼体10条，最少3条。

水体中微塑料对重金属汞的吸附行为及其对涡虫的毒性效应

环境中的微塑料(MPs)污染日益增加,已经成为备受关注的全球环境问题。已有研究表明,微塑料通过自身的物理效应和吸附作用,能够吸附重金属等污染物,产生“特洛伊木马效应”。因此,微塑料与重金属之间的相互作用在风险评估中具有特殊且重要的意义。以聚苯乙烯(PS)为例,选用东亚三角涡虫作为实验动物,探究微塑料吸附重金属汞(Hg)后的生物效应和毒性机制。采用红外光谱、扫描电子显微镜、动态光散射分析对PS-MPs及PS-Hg^(2+)进行详细表征。急性毒性实验表明,Hg^(2+)对整体涡虫的半数致死浓度(LC_(50))值为0.13 mg/L,对再生涡虫的LC_(50)值为0.12 mg/L。Hg^(2+)能够在涡虫体内富集,并产生毒性效应,导致涡虫死亡和胚基生长的抑制。此外,结合同步辐射X射线荧光光谱成像(XRF)和原子荧光光谱仪(AFS)分析技术,发现PS-MPs会增强Hg^(2+)在涡虫体内的富集和毒性。通过组织学分析、原位杂交、免疫荧光及测定SOD、MDA、ATP含量、ATP合酶和GPX4活性、线粒体膜电位及线粒体中Fe^(2+)的相对水平和总Fe含量,发现Hg^(2+)会引起涡虫组织学损伤,影响涡虫体内Neoblasts的维持与增殖,引起涡虫抗氧化防御系统的紊乱、细胞损伤和线粒体功能的破坏,而PS-MPs的引入会加剧这些现象。综上所述,PS-MPs与Hg^(2+)具有联合作用,PS-MPs的加入能够增强Hg^(2+)的毒性,扰乱涡虫的稳态。因此,应重视微塑料与重金属的联合作用,并从多方面进行污染物的风险评估。

东亚三角涡虫RhoA基因的原核表达及组织定位

为了表达东亚三角涡虫RhoA蛋白,采用温控表达载体pBV220-IL1,构建了原核表达重组质粒pBV220-IL1-RhoA,转化到E.coli DH5α中,利用42℃热激诱导表达,并进行了分离纯化和Western杂交鉴定,利用荧光免疫组织化学技术检测了在涡虫体内的分布。SDS-PAGE电泳表明诱导表达的融合蛋白约为18 kDa,Western杂交结果显示是目的蛋白,荧光免疫组织化学结果表明RhoA蛋白在东亚三角涡虫神经系统处表达。

东亚三角涡虫肌球蛋白轻链(MLC)融合蛋白原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

构建了涡虫肌球蛋白轻链融合蛋白原核表达载体,并进行表达,根据涡虫基因文库中肌球蛋白轻链(MIc)基因完整的ORF序列设计合成特异性引物,通过PCR扩增涡虫MIc基因,并插入到融合蛋白原核表达载体PET-28a中,转化宿主菌BL21(DE3)细胞,0.4mMol/L的IPTG诱导表达MLC蛋白.重组质粒测序和酶切结果显示Mlc基因已正确插入PET-28a中,重组蛋白经SDSPAGE在18.2KD处有一条明显的蛋白表达条带。western blot检测得到同样大小的条带。结果表明,涡虫His-MLC融合蛋白已成功表达。

双酚A暴露对东亚三角涡虫急性毒性及神经酶的影响

旨在探讨双酚A (BPA)对东亚三角涡虫的急性毒性及神经系统相关酶活性的影响。采用不同浓度的BPA处理涡虫24 h、48 h、72 h,求出半致死浓度,以此为基础,采用不同浓度的BPA处理涡虫24 h、72 h、144 h,测定AchE、ChAT及Na+~K+^-ATP酶活性。BPA对三角涡虫的24 h、48 h、72 h,LC50分别为12.18 mg/L、8.49 mg/L、6.43 mg/L。ChE、ChAT、Na+~K+^-ATP酶活性对BPA反应敏感,具有较好的规律性。24 h处理组,AChE酶活力随BPA浓度的升高而升高,72 h和144 h处理组则呈现先上升后下降的趋势,除0.643 mgBPA/L以外,其它处理组均表现出了时间-效应关系;在BPA胁迫下,ChAT酶活力均呈现降低趋势,在BPA浓度为0.643 mg/L、1.286 mg/L时,表现出了时间-效应关系;24 h、72 h处理组Na+~K+^-ATP酶活力随BPA浓度升高呈现先上升后下降的趋势,144 h处理组则呈现下降趋势,Na+~K+^-ATP酶活力随BPA胁迫时间的延长呈现先升高后下降的趋势。BPA对涡虫具有较强的生态毒性,AchE、ChAT、Na+~K+^-ATP酶活性可与其他敏感指标一起作为水体BPA污染的早期监测指标。

珞珈山东亚三角头涡虫群体遗传多样性贫乏的RAPD证据

无脊椎动物是在生物多样性中占优势的类群,生物多样性研究还未受人们重视。遗传多样性研究是生物多样性研究的重要方面,采用RAPD技术分析了取样于武汉大学珞珈山的一个东亚三角头涡虫群体,该群体多态位点比例为11.3%,遗传相似度0.9505～1.0000,平均遗传相似度为0.9784,Shannon多样性指数为0.180,UPGMA聚类分析显示该群体分为两个大的分支,各项参数显示该群体的遗传多样性贫乏。根据RAPD分析结果,该东亚三角头涡虫群体遗传多样性贫乏与其周围生境退化有关,也可能与东亚三角头涡虫具有无性生殖和有性生殖这一独特的繁殖方式相关。

p53同系物Djp53在涡虫胚基早期发育阶段的组织特异性表达及其在再生中的作用

为了探索东亚三角涡虫Djp53基因在涡虫组织中的表达和功能,利用整体原位杂交、RT-PCR技术,检测了涡虫Djp53基因在组织中的表达分布特点,结果表明,Djp53基因在再生1、3、5天的胚基中具有较强的阳性信号,且3天的表达量最高;而在再生7、10天和成虫的实质组织中表达较弱.RNA干扰后的RT-PCR检测显示,Djp53表达量显著下降,涡虫不能正常再生或出现眼点缺陷.由此推断,东亚三角涡虫Djp53基因在早期胚基发育阶段,通过调节多功能干细胞的迁移和增殖分化影响早期胚基的形成,是涡虫早期胚基发育必不可少的一个基因,并且在涡虫成体和再生后期对多功能干细胞的维持具有重要的作用.