东亚钳蝎抑制型神经毒素基因在昆虫细胞中的表达及活性鉴定

基因BmKIT3R 是根据东亚钳蝎 (ButhusmartensiiKarsch)抑制型神经毒素基因BmKIT3 优化而得的 .将优化过的蝎毒素基因BmKIT3R 通过Bac to Bac操作技术 ,使重组杆状病毒基因组DNA转染到草地粘虫sf2 1细胞中对IT3R 基因进行表达 ,经SDS PAGE检测在 8.7× 10 3 处有一表达条带 .表达产物经生物鉴定 ,证明具有很高的活性 ,它对昆虫具有非常明显的致死作用 .图 3参

东亚钳蝎神经毒素在大肠杆菌中的表达

以山西风陵渡东亚钳蝎（ＢｕｔｈｕｓｍａｒｔｅｎｓｉＫａｒｓｃｈ）的尾腺总ＲＮＡ为模板，根据已知的蝎神经毒素保守氨基酸序列设计引物，利用ＰＣＲ技术，扩增并克隆了两个蝎神经毒素基因．序列分析表明，由两个基因导出的氨基酸序列（ＢｍＫＭｍ１和ＢｍＫＭｍ２）与已知的蝎神经毒素ＢｍＫⅠ、ＢｍＫⅡ、ＢｍＫⅢ、ＢｍＫＭ１、ＢｍＫＭ９有很高的同源性．将ＢｍＫＭｍ２基因重组到大肠杆菌分泌型表达载体ｐＥｘＳｅｃ１中进行表达．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明表达产物被分泌到细胞周间质及培养液中．

东亚钳蝎神经毒素BmK CT三维结构分子建模及晶体生长条件的初步筛选

东亚钳蝎是一类广泛分布于我国且具有重要药用价值的野生资源。其氯离子通道神经毒素(BmK CT)对人脑神经胶质瘤细胞具有靶向特异性的抑制作用。利用SWISS-MODEL服务器对BmK CT进行蛋白质原子结构的同源建模,利用Insight Ⅱ软件包对建模结果做能量最小化和分子动力学优化,获得最佳候选模型。三维结构对比分析表明,BmKCT与以色列蝎氯通道毒素(Cltx)三维结构极为相似,均由一个α-helix和两个反向平行的β-sheet构成,但BmKCT属于βαβ型,而Cltx属于αββ型。表面静电势分析表明,BmKCT和Cltx分子表面分布着大量正电势,暗示两分子功能相似,且其中的碱性氨基酸及产生的正电势对其与受体结合起决定作用。采用晶体生长试剂盒(Crystal ScreeningKit)中的51个缓冲液配方筛选BmKCT的结晶条件,在7号配方(1.4 mol/L乙酸钠,0.1 mol/L甲次砷酸钠,pH6.51中筛选到柱状六边形晶体。

两个东亚钳蝎神经毒素cDNA的克隆和序列分析

构建了东亚钳蝎毒腺组织 c DNA文库 ,用 PCR筛选到两个新的神经毒素全长 c DNA,其开放阅读框(ORF)包括 :信号肽、成熟毒素和 /或额外氨基酸序列 ,它们编码的成熟毒素分别命名为 BmαTX9和 Bm IT( cp) 2 .序列分析表明 ,BmαTX9为抗哺乳动物神经毒素 ;Bm IT( cp) 2为痉挛型昆虫毒素 .文章还对东亚钳蝎神经毒素的命名 ,分类以及进化等问题进行了初步的探讨 .

东亚钳蝎神经毒素基因BmK IT_3的克隆及其在大肠杆菌中的表达

According to the reported sequence of \%Buthus martensii\% Karsch scorpion toxin gene (BmK IT 3),we synthesized two primers,which were complementary in a region.By the means of PCR,we got the gene.The gene was fused in expression vector pET-28a,which gave rise to a recombinant plasmid pET(IT 3 R).Then it was transformed into \%E.coli\% BL21 (DE 3).With IPTG induction,the gene was efficiently expressed.And the fusion product was soluble.

东亚钳蝎神经毒素基因BmKCT的克隆与表达

从蝎毒腺中提取总RNA,通过RT-PCR得到东亚钳蝎神经毒素BmKCT的cDNA,将其连接到pUCm-T载体中。序列分析表明,该基因开放阅读框架编码59个氨基酸残基,其中24个为信号肽,其余35个为成熟肽,与Genebank上登录的相同。将蝎神经毒素cDNA再经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pTrcHisA表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导可高效表达分子质量为10ku左右的融合蛋白。表达产物约占菌体总蛋白的25%。

东亚钳蝎神经毒素基因的序列相似性分析

目的对东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)神经毒素基因进行多序列比对,找到基因的结构特征,在此基础上对序列进行聚类分析,进而推测基因结构与功能的关系。方法搜集目前已知的东亚钳蝎神经毒素基因序列,利用Clustal X1.83软件进行多序列联配,然后用MEGA软件对基因组基因进行聚类分析。结果与结论东亚钳蝎神经毒素基因结构与功能密切相关,而且结构符合断裂基因的基本规律,如果这些基因结构基本一致,是由2个外显子和1个内含子组成,内含子的位置保守,位于信号肽中,基因长度的变化由内含子长度决定。

一种东亚钳蝎碱性神经毒素的纯化和初步晶体学研究

经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０和ＳＰ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５两次柱层析，从河南淅川马氏钳蝎毒素中分得一种碱性神经毒素ＢｍＫＭＩ８．等电聚焦和ＳＤＳ电泳显示单一组分，其ｐＩ为９．１，Ｍｒ为７１００．毒性测试结果表明，该组分对小白鼠有较强的毒性，对昆虫也有一定的毒性，已获得该毒素的两种晶型的大单晶，并测定其空间群为Ｐ２＿１２＿１２＿１，晶胞参数为：ＢｍＫＭＩ８－Ａ：ａ＝３６．７，ｂ＝２６．６，ｃ＝５２．０，ＢｍＫＭＩ８－Ｂ：ａ＝３６．６４Ａ，ｂ＝３７．３１，ｃ＝３７．９５，已收集了ＢｍＫＭＩ８－Ｂ分辨率为１．７４的Ｘ射线单晶衍射数据。

蝎昆虫神经毒素BmK IT的基因克隆、表达和生物活性检测

根据Genbank中蝎昆虫神经毒素BmK IT成熟肽编码序列设计引物,从东亚钳蝎蝎尾cDNA pool中克隆获得BmK IT的基因,构建表达载体pSYPU-BmK IT,并在大肠杆菌中实现了非融合可溶性表达。表达产物用金属离子螯合色谱进行分离纯化,纯度在85%以上。重组BmK IT对家蚕表现出神经毒性,而对小鼠无毒。通过同源建模以及与蝎哺乳动物毒素、蝎抑制性昆虫神经毒素的三维结构进行比对,分析了其结构与功能关系。

Bukatoxin对大鼠背根神经节神经元河豚毒素不敏感型钠离子通道电流的影响

目的:研究东亚钳蝎毒素Bukatoxin对大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元河豚毒素不敏感型(tetrodotoxin-resistant,TTX-R)钠离子通道电流(INa)的影响。方法:在急性分离的大鼠DRG神经元上,应用全细胞膜片钳技术,观察Bukatoxin对DRG神经元TTX-RINa的影响。结果:Bukatoxin浓度依赖性地抑制TTX-RINa。在刺激电压为-10mV时,20、40、80μg/ml的Bukatoxin对TTX-RINa峰值的抑制率分别为(18.72±1.27)%、(27.40±4.97)%和(59.02±4.71)%。半数抑制浓度(IC50)为66.28μg/ml,Hill系数(h)为1.48;80μg/ml的Bukatoxin可以使TTX-RINa激活曲线向去极化方向移动约3mV,稳态失活曲线向超极化方向移动6mV。结论:Bukatoxin可以浓度依赖性的抑制DRG神经元上TTX-RINa,并改变TTX-RINa的激活和稳态失活特性,这可能是其降低外周伤害性信息传入,参与伤害性信息调制的机制之一。

蝎神经毒素在大肠杆菌中的非分泌非融合表达

构建一种温控型蝎神经毒素重组表达质粒以及一种IPTG诱导的非分泌非融合型重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中进行了表达研究。

两个东亚钳蝎抑制型昆虫毒素cDNA的克隆及序列分析

蝎在长期的进化过程中逐步形成了一套为生存所需的毒素成分。蝎毒贮存于蝎子尾刺的毒囊内,它不仅是蝎子捕食御敌的必要武器,也是人类用来治疗某些疾病的良药。蝎毒按其作用的对象可分为3类:作用于哺乳动物的神经毒素、作用于甲壳纲类动物的神经毒素和作用于昆虫的神经毒素。这些毒素现已作为有效工具物被广泛地应用于相关离子通道的研究中。

一种东亚钳蝎酸性神经毒素的晶体学研究

蝎广泛分布于世界各地,存在于我国的主要是东亚马氏钳蝎(Buthus martensi Karsch以下简称BmK).其毒腺分泌毒液,经尾部毒针伤害人畜.现在知道,蝎毒液中的有效毒性成分是一组由30-80个氨基酸组成的多肽和蛋白质,具有神经毒性.其毒性作用来自它们与可兴奋膜结合并提高其去极化能力,从而引起从突触前神经末梢来的神经递质的过量释放.这种作用发生在钠通道水平.显然,阐明蝎毒蛋白的三维结构对研究离子通道作用机理和膜中配体-受体相互作用本质有重要意义.同时,由于蝎毒神经毒素形成一族同源蛋白质,并随其一级结构的不同而出现毒性和作用专一性的显著差异。

BmKNJX10对大鼠背根神经节神经元外向钾电流的影响

目的:作者运用柱层析和高效液相色谱的方法,从东亚钳蝎毒素中分离纯化获得一个长链组分BmKNJX10, 质谱报告结果显示其相对分子质量为7214。本文研究其对神经元钾电流的影响。 方法:采用全细胞膜片钳技 术,观察了BmKNJX10对大鼠背根神经节(DRG)神经元外向钾电流(IK)的作用。 结果:BmKNJX10以浓度依赖 的方式对IK有明显的促进作用。在刺激电压为+20mV时,10mg/L、30mg/L、50mg/L和70mg/LBmKNJX10对 IK的增大率分别为(17.1±3.9)%(n=4)、(25.1±6.2)%(n=4)、(45.3±2.8)%(n=5)和(70.2±11.1)%(n= 3)。 结论:BmKNJX10具有开放钾通道的功能,可能属于一个新的钾通道毒素多肽。

东亚钳蝎4个软瘫型抗昆虫神经毒素的纯化及其分子特征

本文首次直接用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch)粗毒进行了分离,获得了至今关于该毒神经毒素组分的最佳分离和高回收得率的图谱,如本法可将哺乳动物毒素(包括兼有哺乳动物毒性的昆虫毒素)和只有昆虫毒性的昆虫毒素分成两个区,并从后一区中纯化了多至5个抗昆虫毒素(分别将它们定名为BmK IT1至IT5)。毒性检测、氨基酸组成分析及N-端3肽序列测定结果表明,除其中的BmK IT1应为前文报道的BmK IT(挛缩型抗昆虫毒素)外,BmK IT2至IT5则都是新发现的软瘫型抗昆虫毒素。该4个毒素都是偏碱性的、由约61个氨基酸残基组成的单链多肽,等电点均在8.3至8.5之间。当BmK IT2分子被荧光物质标记修饰后,生物毒性便丧失。揭示这类毒素分子表面带正电荷的残基对维系其生物活性应同样是至关重要的。

东亚钳蝎毒中Alpha型昆虫神经霉素的HPLC纯化及其部分氨基酸顺序

蝎毒中存在着多种神经毒素,其中除个别小分子多肽成分被证实是神经细胞膜上钾离子通道的阻断剂外,绝大部分是一类选择性地影响电压敏感钠离子通道的、由60—70个氨基酸残基组成的单链多肽。蝎神经毒素作为一种工具物已被广泛地应用在神经电信号传导机制的基础理论研究中。文献[1,2]曾报道了从国产东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch)毒中纯化的2个哺乳动物神经毒素(BmK Ⅰ和Ⅱ)和一个被命名为BmK IT的昆虫神经毒素,并分别确立了它们的完整蛋白初级结构。本文将报道东亚钳蝎毒中另一个昆虫神经毒素BmK aIT的HPLC纯化及其部分氨基酸排列顺序的测定结果。

东亚钳蝎昆虫毒素BmK IT的初级结构研究

从中国产东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch)毒中纯化的一个昆虫毒素BmK IT经还原和羧甲基化处理后,分别用TPCK-胰蛋白酶和金黄色葡萄球菌蛋白酶进行用TLC-薄膜分离酶解的肽段并分别测定了它们的氨基酸顺序。将BmK IT及其酶解肽段的氨基酸顺序的测定结果与由非洲产蝎Androctonus australis Hector毒中纯化的昆虫毒素AaH IT的初级结构进行参照对比,我们发现两种昆虫毒素的分子结构中仅有16个残基部位发生了变异,其同源性高达75％以上。这一结果为探讨蝎昆虫毒素的分子结构特征以及结构与功能的相互关系提供了重要资料,也为这类毒素的开发利用,如作为神经生物科学研究中的工具物或探讨作为生物杀虫剂的可能性等提供了必要的分子基础。

我国东亚钳蝎昆虫毒素的研究概况

综述了我国东亚钳蝎（Buthus martensii Karch)昆虫神经毒素的分离，纯化，性质，基因，结晶及晶体学研究的概况。

东亚钳蝎氯毒素在胶质瘤靶向显像与治疗中的研究进展

神经胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，尤其是恶性胶质瘤，具有高复发率和致死率的特点。因其侵袭性生长，目前采取的手术联合放化疗的综合治疗方案疗效欠佳。如何靶向显像和治疗胶质瘤成为研究的重点。近年来，大量研究表明，作为氯毒素的类似物，东亚钳蝎氯毒素能特异性地结合神经胶质瘤细胞表达的氯离子通道和基质金属蛋白酶2，从而抑制胶质瘤细胞的侵润生长和迁移。以东亚钳蝎氯毒素为配体的生物结合物在胶质瘤靶向显像和治疗中的研究越来越多。笔者将全面介绍东亚钳蝎氯毒素的来源、化学结构、作用机制及其在胶质瘤靶向显像与治疗中的应用研究进展，并总结其优势及在未来研究中所面临的挑战。

太原市“十一五”期间科学技术杰出贡献奖

山西大学和山西省农业生物技术研究中心从我国特色资源东亚钳蝎的应用出发。采用现代生化和分子生物学研究手段，对其中的昆虫特异性毒素基因（BmKIT）和神经胶质瘤特异，眭毒素基因（BmKCT）进行克隆、定向改造，对其基因产物的性质、