东亚钳蝎神经毒素基因BmK IT_3的克隆及其在大肠杆菌中的表达

According to the reported sequence of \%Buthus martensii\% Karsch scorpion toxin gene (BmK IT 3),we synthesized two primers,which were complementary in a region.By the means of PCR,we got the gene.The gene was fused in expression vector pET-28a,which gave rise to a recombinant plasmid pET(IT 3 R).Then it was transformed into \%E.coli\% BL21 (DE 3).With IPTG induction,the gene was efficiently expressed.And the fusion product was soluble.

东亚钳蝎神经毒素基因BmKCT的克隆与表达

从蝎毒腺中提取总RNA,通过RT-PCR得到东亚钳蝎神经毒素BmKCT的cDNA,将其连接到pUCm-T载体中。序列分析表明,该基因开放阅读框架编码59个氨基酸残基,其中24个为信号肽,其余35个为成熟肽,与Genebank上登录的相同。将蝎神经毒素cDNA再经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pTrcHisA表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导可高效表达分子质量为10ku左右的融合蛋白。表达产物约占菌体总蛋白的25%。

东亚钳蝎神经毒素基因的序列相似性分析

目的对东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)神经毒素基因进行多序列比对,找到基因的结构特征,在此基础上对序列进行聚类分析,进而推测基因结构与功能的关系。方法搜集目前已知的东亚钳蝎神经毒素基因序列,利用Clustal X1.83软件进行多序列联配,然后用MEGA软件对基因组基因进行聚类分析。结果与结论东亚钳蝎神经毒素基因结构与功能密切相关,而且结构符合断裂基因的基本规律,如果这些基因结构基本一致,是由2个外显子和1个内含子组成,内含子的位置保守,位于信号肽中,基因长度的变化由内含子长度决定。

蝎昆虫神经毒素BmK IT的基因克隆、表达和生物活性检测

根据Genbank中蝎昆虫神经毒素BmK IT成熟肽编码序列设计引物,从东亚钳蝎蝎尾cDNA pool中克隆获得BmK IT的基因,构建表达载体pSYPU-BmK IT,并在大肠杆菌中实现了非融合可溶性表达。表达产物用金属离子螯合色谱进行分离纯化,纯度在85%以上。重组BmK IT对家蚕表现出神经毒性,而对小鼠无毒。通过同源建模以及与蝎哺乳动物毒素、蝎抑制性昆虫神经毒素的三维结构进行比对,分析了其结构与功能关系。

太原市“十一五”期间科学技术杰出贡献奖

山西大学和山西省农业生物技术研究中心从我国特色资源东亚钳蝎的应用出发。采用现代生化和分子生物学研究手段，对其中的昆虫特异性毒素基因（BmKIT）和神经胶质瘤特异，眭毒素基因（BmKCT）进行克隆、定向改造，对其基因产物的性质、

表达蝎毒素的重组斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)的构建及毒力

【目的】开发高毒力的重组斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedroviruse,SpltMNPV)杀虫剂。【方法】构建编码蜕皮激素UDP-葡萄糖基转移酶(ecdysterioid UDP-glucosyl transferase gene,egt)基因缺失并插入东亚钳蝎神经毒素(B.martensi Karsch,BmK ITa1)基因的重组转移载体,重组转移载体与SpltMNPVⅡ基因组DNA共转染斜纹夜蛾细胞,通过荧光斑法与有限稀释法相结合筛选重组病毒。【结果】成功筛选出缺失egt基因的、早期启动子(ie-1)启动的、表达BmK ITa1成熟肽的重组病毒SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-ie-1-BmK ITa1。生物测定结果显示,重组病毒的杀虫速度(LT50)较野生病毒提前0.7-0.8 d。【结论】通过在SpltMNPV病毒基因组中插入外源毒素基因可明显增强病毒的杀虫效果,结果说明开发高毒力SpltMNPV生物杀虫剂具有可行性。