东北黑熊粪肠球菌的分离鉴定及药敏分析

为了分离、鉴定黑熊粪肠球菌延边株,以及预防粪肠球菌在该区养熊业的流行,试验利用死亡黑熊为试验材料,无菌采集病料并分离病原体进行培养,应用革兰氏染色镜检、生化反应及AMOSPCR分子生物学方法进行初步鉴定,对分离得到的菌株进行豚鼠毒力试验和药物敏感试验。结果表明:分离得到的菌株为革兰氏阳性双球菌,经生化试验和PCR鉴定为粪肠球菌,该菌对豚鼠的最小致死量为5.4×10~7cfu/500μL,对头孢唑啉、万古霉素、磷霉素、青霉素、链霉素、庆大霉素较为敏感,对磺胺甲氧嘧啶耐药。

东北黑熊源粪肠球菌EfaA基因的克隆表达及生物信息学分析

为检测熊源粪肠球菌心内膜炎抗原(EfaA)基因,用于快速检测东北黑熊粪肠球菌感染病例,本试验根据GenBank登录的粪肠球菌EfaA基因序列(登录号:U03756.1)合成了1对PCR引物,通过PCR法扩增合成长度为689bp的目的片段。将PCR产物克隆于pMD19-T载体,之后将其转入大肠杆菌DH5α感受态细胞筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-EfaA并进行PCR、酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果显示,本试验成功克隆出熊源粪肠球菌EfaA基因,与GenBank登录的ATCC 29212菌株同源性为100.0%。本试验成功构建了重组克隆载体pMD19-T-EfaA,并对测序结果进行了蛋白质结构的预测,为进一步建立黑熊粪肠球菌病的诊断方法提供了理论依据,同时也为黑熊疾病的防制奠定了基础。

一起东北黑熊死亡病例的病毒宏基因组学分析

黑熊是我国重要的野生动物资源,保护黑熊是我国野生动物保护的重要内容之一。本研究使用常规细菌检测和病毒组学分析,对一起黑熊死亡案例进行病原分析。细菌学检测发现了肠出血性大肠杆菌和A型魏氏梭菌阳性,但结合临床症状,排除了细菌感染的可能。随后使用RNA和DNA病毒组技术相结合,对其进行全病毒组分析,结果发现了Parvovirus、Anellovirus、Circovirus等7个病毒信息,其中肾脏携带的病毒最为丰富,有7个科。在这些病毒中,Parvovirus、Anellovirus和Circovirus与已知病毒核苷酸同源性小于90%,而其余病毒与当前已知病毒同源性高达99%。绝大多数病毒致病性不明确,值得注意的是本研究发现的细小病毒在黑熊中呈现系统感染,且与美国的一株熊细小病毒NS1氨基酸同源性为86.8%,但其与此次黑熊死亡的关联需进一步研究。本研究首次用病毒组技术对黑熊样本病毒组进行分析,结果虽不能判定此次黑熊死亡的原因,但相关数据为了解黑熊病毒多样性提供了重要的基础数据。

东北黑熊养殖群体6个微卫星基因座遗传多态性研究

利用微卫星标记研究东北黑熊养殖群体的遗传多态性,及时掌握养殖群体的相关遗传信息,为今后黑熊的人工繁殖及育种、保种工作奠定基础。本研究选取了黑熊的6个微卫星基因座(MSUT2、MSUT4、UT3、UT35、UT36、UT38)对115头东北黑熊进行了遗传检测,利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA分型以及ABI 3730遗传分析仪进行基因大小的判读,计算了6个微卫星位点的等位基因频率、多态信息含量(PIC)、杂合度等值。结果表明:东北黑熊养殖群体的6个微卫星座位共检测到51个等位基因,平均为8.5个;6个微卫星基因座的平均多态信息含量为0.641 9,其中5个微卫星基因座的PIC>0.5,6个微卫星基因座的平均观察杂合度、平均期望杂合度分别为0.529 9、0.641 7。数据证明,6个微卫星标记均具有高度多态性,可用于东北黑熊的遗传多样性分析。

东北黑熊粪肠球菌PCR检测方法的建立及应用

为建立一种基于细菌16S r DNA的粪肠球菌PCR检测方法,用于快速检测东北黑熊粪肠球菌感染病例,通过死亡黑熊脏器中提纯的粪肠球菌测序结果与NCBI中的粪肠球菌16S r DNA序列(登录号:NZ_AJXO01000024.1)的比对,设计了1对特异性PCR引物,并对PCR反应条件、敏感性和特异性进行了测定。结果表明,扩增条带与预期的产物大小一致,经过测序结果分析,证明该条带为目的条带,其他种属的菌株未见条带;并且当引物工作剂量为0.2 L、酶工作剂量为0.15 L就可以扩增出清晰的目的条带,该方法的最小检出量为86 CFU;通过对13头份来自延边熊场的患病(4头)和健康(9头)黑熊粪便检测,患病样本检验结果均为PCR阳性,表明该特异性PCR诊断方法能简易、快捷地检测粪肠球菌,为进一步建立黑熊粪肠球菌病的诊断方法提供理论依据,同时也为黑熊疾病的防治奠定了临床基础。

黑熊线粒体12S rRNA基因的克隆及序列分析研究

为了解东北长白山黑熊线粒体基因的遗传学特点,本研究利用已报道的部分熊科动物的线粒体基因的保守序列。本文采用PCR技术,首次从延边圈养的黑熊的全血总DNA中扩增出了线粒体12S rRNA基因,基因长度为967 bp。将PCR产物纯化回收后克隆于pMD18-TVector,成功构建了重组克隆质粒。并与已报道的四川黑熊、日本黑熊进行了序列比较分析,结果表明,长白山黑熊与四川黑熊的亲缘关系比较近,在序列上具有较高的相似性。该研究为长白山黑熊遗传物种鉴定和多样性研究提供了重要的参考依据,也为更深入的研究亚洲黑熊分子生物学提供了重要的参考。