广东蚊东南亚十二节段病毒属芒市病毒的分离与鉴定

为了解广东蚊携带虫媒病毒的情况,2014年6月在汕头市濠江区采集蚊标本,用细胞培养法分离病毒,对病毒分离物进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,测定S1、S2、S3片段序列,并对序列进行同源性和系统进化分析。从采集到的蚊中分离到2株致C6/36细胞产生病变的分离物(编号为GD1和GD7)。电镜观察显示,完整病毒颗粒呈球形,直径约66 nm,无包膜。琼脂糖凝胶电泳结果显示,GD1和GD7两株新分离病毒基因组为12节段,其带型与2015年仅在云南新分离出的东南亚十二节段病毒属芒市病毒相似。新分离的2株病毒GD1和GD7的S1、S2、S3片段核苷酸序列同源性均为100%,与芒市病毒DH13M041核苷酸序列同源性最高,均为98.2%、99.2%、98.5%,而与十二节段病毒属中其他病毒如版纳病毒、辽宁病毒、卡皮罗病毒和Balaton病毒核苷酸序列同源性分别低于69.1%、62.7%、57.6%。GD1和GD7两株病毒S1、S2、S3片段核苷酸序列系统进化分析结果均显示,2株新分离病毒的亲缘关系最近,且与芒市病毒DH13M041位于同一分支上,亲缘关系较近,而与东南亚十二节段病毒属其他病毒具有明显差异。提示这2株广东新分离病毒为芒市病毒,这是除云南以外地区首次分离到该病毒,此次在广东分离到芒市病毒扩大了对东南亚十二节段病毒属病毒地域分布的了解。

东南亚十二节段双链RNA病毒的分子进化及基因组结构特征分析

目的了解东南亚十二节段双链RNA病毒(South-East Asian dodeca RNA viruses,Seadornavirus)的分子进化规律及遗传差异。方法基于Seadornavirus衣壳蛋白基因组序列进行同源性、系统进化、理化性质、抗原表位预测以及三级结构和表面电荷分布的分析。结果Seadornavirus的最近共同祖先大约于2359年前,分为3个进化簇,其进化时间分别为约距今1338、499、253年前,其平均核苷酸替换率为3.6×10-4n/s/y。Seadornavirus 3种病毒之间的核苷酸与氨基酸同源性分别是31.3%~100%(μ=68.0%)和11.9%~100%(μ=56.0%)。理化性质和抗原表位分析显示,版纳病毒(Banna virus,BAV)衣壳蛋白为酸性疏水性蛋白质,存在6个B细胞表位和2个Th抗原表位,而辽宁病毒(Liaoning virus,LNV)和卡迪皮诺病毒(Kadipiro virus,KDV)为碱性亲水性蛋白质,分别存在3和5个B细胞抗原表位,其中LNV仅有1个Th抗原表位,KDV病毒则不存在。三级结构以及蛋白表面电荷分析显示,Seadornavirus的α螺旋和β折叠各不相同,并且BAV有2个明显的带正电荷区域和2个带负电荷的区域,LNV只有1个带正电荷区域,KDV则有2个带正电荷区域。结论Seadornavirus进化速率快,并且其基因组、衣壳蛋白抗原表位、理化性质、三级结构等具有较大的差异。

版纳病毒及其感染

版纳病毒于1987年首次分离自我国云南省西双版纳地区采集的发热和脑炎患者脑脊液和血清标本,是呼肠孤病毒科新建立病毒属——Seadornaviru(s东南亚十二节段RNA病毒属)的模式病毒。作为一个新分离的与人类疾病关系密切的病毒,版纳病毒引起了相关学术界的广泛关注。现就版纳病毒的病原学特征、地理分布、媒介、人畜感染情况等方面的研究进展做一综述。

中华按蚊分离的版纳病毒全基因组序列测定与分子遗传进化分析

目的对分离自中华按蚊的版纳病毒进行病毒全基因组核苷酸序列测定和分子遗传学分析。方法使用分子病毒学方法测定病毒全基因组12节段核苷酸序列,以生物信息学软件进行序列比对、同源性和分子遗传进化分析。结果 2012年从云南省中缅边境地区中华按蚊分离的版纳病毒(YN12234病毒株)能在C6/36细胞引起细胞病变并稳定传代,该病毒为12节段RNA病毒。根据病毒VP1蛋白(RdRp)氨基酸序列进行的分子遗传进化分析发现,YN12234病毒属于呼肠孤病毒科东南亚12节段RNA病毒属版纳病毒。对第12节段基因序列的进一步分析显示,YN12234病毒属于A2基因型版纳病毒。系统进化分析结果还显示,从中华按蚊分离的版纳病毒与此前从中华按蚊分离的版纳病毒处在不同进化分支,且不同蚊虫分离的版纳病毒并非聚类在共同的进化分支。结论从中华按蚊分离的YN12234病毒株属于含有12节段的版纳病毒,分子进化分析结果提示包括云南省分离的YN12234病毒在内的目前国内外从蚊虫分离的版纳病毒并不存在病毒与蚊虫种类之间的媒介适应性。

两株云南省新分离版纳病毒的鉴定及序列分析

目的对云南省中缅边境地区采集的蚊虫进行版纳病毒(BAV)的分离鉴定。方法2013年6月在云南省德宏州芒市牛圈采集蚊虫样本,分别接种BHK-21、C6/36、Vero细胞分离病毒,用RT-PCR方法鉴定,并进行序列分析。结果从采集的蚊虫中分离到2株分离物(C23、C36),接种C6/36细胞6 d后产生细胞规律病变,而在BHK21和Vero细胞上不出现细胞病变;PAGE电泳显示2株新分离病毒为12个节段双链RNA病毒,其带型为6-4-2;BAV第12节段特异性引物扩增为阳性,测序获得2株新分离病毒第12节段序列,序列分析显示2株新分离病毒序列与BAV位于相同的进化簇中,核苷酸同源性在92.1%~96.3%之间;与云南省和越南分离的7株BAV遗传进化关系较近,核苷酸同源性在94.5%~96.3%之间,而与我国辽宁、甘肃和山西分离的BAV遗传进化关系较远,核苷酸同源性均低于93.6%。结论从芒市蚊虫中分离的C23和C36病毒为BAV,遗传进化关系与云南省以前分离的毒株较近。