云南省德宏州东方库蠓中西藏环状病毒的分离鉴定

目的了解云南省德宏傣族景颇族自治州(德宏州)芒市采集库蠓携带西藏环状病毒(TIBOV)情况及其潜在传播媒介,丰富云南边境地区环状病毒的研究。方法2016年8月在德宏州芒市郊区的牛舍和羊舍用诱蚊灯夜间采集蠓,对采集到的蠓在显微镜下进行初步分类,采用金黄地鼠肾细胞(BHK-21)和白纹伊蚊卵细胞(C6/36)进行病毒分离,阳性分离物分别使用甲病毒属、黄病毒属、TIBOV S7和S10特异引物进行鉴定,对阳性扩增产物测序,采用MEGAⅩ等生物信息软件进行序列分析。同时,提取相应库蠓基因组DNA,采用细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)特异引物鉴定库蠓种类。结果将采集到的库蠓分44批研磨,获得1株可引起BHK-21和C6/36细胞病变的毒株(编号:DHC217-11),接种标本研磨的上清液48 h后,BHK-21细胞出现明显病变;接种标本研磨的上清液72 h后,C6/36细胞出现明显病变。甲病毒属、黄病毒属引物扩增均为阴性,TIBOV S7和S10引物扩增均为阳性,测序后分别获得新分离病毒第7节段(S7)1085 bp和第10节段(S10)723 bp序列。序列分析结果显示,新分离DHC217-11株病毒在S7和S10基因序列构建的遗传进化树上,与6株TIBOV位于同一个进化分支内,它们之间的核苷酸同源性分别为93.4%~99.5%(S7)和81.3%~97.1%(S10),而与蓝舌病毒、鹿流行性出血热病毒等其他环状病毒位于不同进化分支,核苷酸同源性低于62.7%(S7)和58.9%(S10);进一步分析发现新分离DHC217-11株病毒S7基因序列与2013年芒市库蠓分离TIBOV DH13C120株核苷酸同源性最高,为99.5%,S10基因序列与2017年西双版纳傣族自治州分离的TIBOV SX-2017a株核苷酸同源性最高,为97.1%,提示新分离DHC217-11株病毒为TIBOV。采用库蠓COⅠ基因引物对DHC217-11批库蠓进行分子鉴定,序列分析结果显示DHC217-11批库蠓COⅠ基因序列与东方库蠓遗传进化关系较近,它们之间核苷酸同源性最高为99.8%,提示该批库蠓为东方库蠓。结论从云南省德宏州东方库蠓中分离的DHC217-11为TIBOV,东方库蠓可能是TIBOV潜在的传播媒介。