东方拟无枝酸菌糖基转移酶基因gtfE的克隆(英文)

糖基转移酶基因 gtf E位于万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌 (Amycolatopsisorientalis)染色体上。通过 PCR的方法并对PCR反应条件进行了优化 ,扩增得到了较高产量的 PCR产物。PCR产物经酶切回收后克隆到 p Bluscript KS+质粒载体 ,转化E.coli DH5 α感受态细胞 ,筛选得到一阳性克隆。测序后与文献报道的基因序列做同源比较 ,结果仅有两个碱基的差异。

东方拟无枝酸菌基因工程菌产新糖肽类化合物的发酵条件优化

目的对产新糖肽类化合物的基因工程菌东方拟无枝酸菌HCCB10167的发酵条件进行优化。方法考察了该工程菌的遗传稳定性,对发酵的主要影响因子接种量、初始pH值、温度、摇瓶装量、转速等进行了单因素试验,确定了最佳培养条件,并用均匀设计试验对其发酵培养基进行了优化。结果该工程菌遗传稳定,优化后的产量较起始条件提高1.8倍。结论工程菌保持了万古霉素类抗生素的生产能力,具有规模化生产的潜能。

在东方拟无枝酸菌中建立I-SceI内切酶介导的无标记敲除系统

目的在东方拟无枝酸菌中建立由I-Sce I介导的无标记高效重组系统。方法首先构建可用于东方拟无枝酸菌的I-Sce I操作盒,通过敲除多烯类化合物ECO-0501合成相关基因hem A2,比较操作盒使用前后获得hem A2基因双交换突变株的效率。结果在没有引入I-Sce I的情况下,随机重组的发生几率仅约2%,而导入后,由于I-Sce I酶对引入DNA位点的双链切割,导致双交换重组的发生率提高至90%以上。结论 I-Sce I系统是一种可用于东方拟无枝酸菌无标记遗传操作的有效工具。

东方拟无枝酸菌中基因AORI_2943的敲除对ECO-0501合成的影响

目的对位于ECO-0501生物合成基因簇内AORI_2943基因进行功能鉴定,进一步解析东方拟无枝酸菌中ECO-0501的生物合成途径。方法通过同源重组和定点整合的方式构建AORI_2943缺失、回补及过表达突变株。高效液相及质谱分析突变株发酵产物的变化,分析AORI_2943在ECO-0501合成中的作用。结果 AORI_2943缺失突变株不产ECO-0501和去甲基ECO-0501,只产生结构上缺失了C5N单位(2-氨基-3-羟基环戊-2-烯酮)的前体物质a和b,发酵液中未检测出C5N单位。对缺失突变株回补后,有少量ECO-0501及去甲基ECO-0501产生,同时仍然有大量前体化合物a和b的积累。在野生菌的基础上过表达AORI_2943,并未明显提高ECO-0501的产量。结论 AORI_2943是ECO-0501合成的关键基因,主要参与了ECO-0501前体化合物C5N单位的合成。

东方拟无枝酸菌中ECO-0501生物合成基因簇的筛选及其相关调控基因的初步分析

ECO-0501是从东方拟无枝酸菌代谢物中分离到的一种新型线性多烯类化合物,其不但具有良好的抗菌活性,且体内毒性较低,目前处于临床前的开发。本文通过对东方拟无枝酸菌的菌落原位杂交,筛选到4个粘粒克隆NL5B,NL9-3-1,NL3-1C,NL3-3A,可以覆盖整个ECO-0501生物合成簇,并对其中的基因ORF4进行了生物信息学分析,推测其为ECO-0501合成途径中的正调控基因。并通过该基因的过表达,成功地将ECO-0501的产量提高了6倍,为下一步ECO-0501的开发及其调控机制的研究打下基础。

东方拟无枝酸菌HCCB10007内attB位点的人工构建

目的在万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌HCCB10007内构建attB整合位点,将噬菌体ΦC31重组酶介导的位点特异性整合系统引入该菌,从而提高该工业菌株的遗传操作效率。方法在不破坏结构基因的情况下经同源重组将来源于变铅青链霉菌的attB编码序列插入到东方拟无枝酸菌HCCB10007基因组中,然后将带有绿色荧光蛋白基因(eGFP)的特异性位点重组质粒pLYGYQ2导入该工程菌中。用于验证整合系统的有效性。结果获得基因组中整合有attB位点的基因工程菌LYGYQA。eGFP基因顺利整合入所构建的attB位点,并且获得了表达。同时发现该系统的整合效率较同源重组效率提高了约3倍。结论本研究不但表明来源于链霉菌的位点特异性整合系统可以成功应用于东方拟无枝酸菌中,也证明绿色荧光蛋白基因可以作为报告基因用于该菌的研究。

中心组合设计优化东方拟无枝酸菌发酵生产万古霉素的微量金属离子

对万古霉素生产菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)V-0704摇瓶培养48 h时发酵培养基中添加的几种微量金属离子进行了优化。依次通过部分因子析因设计、最速上升实验、中心组合设计,并利用统计学软件Minitab对实验数据进行分析,得到一组较优的微量金属离子组合:Co2+浓度2.486×10-5g.mL-1、Mo6+浓度2.486×10-5g.mL-1,添加这些金属离子摇瓶培养72 h的万古霉素平均效价达到4946 U.mL-1,较未加金属离子提高了17%。

东方拟无枝酸菌DNA转化系统的建立

对东方拟无枝酸菌HCCB10007原生质体制备和再生条件进行了探索,结果表明以含2%甘氨酸的TSB培养基培养菌丝体,28℃经1mg/ml溶菌酶处理30min,形成的原生质体约达107个/ml,原生质体再生率为2.5%。将来源于HCCB10007的gtfE基因通过安普霉素抗性基因插入失活,构建质粒pLY26并经PEG介导转化HCCB10007原生质体,PCR鉴定结果表明转化成功。

东方拟无枝酸菌产万古霉素发酵工艺优化

采用东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素,通过单因素实验对发酵工艺进行了优化,确定最优发酵工艺为:发酵温度28℃、发酵液pH值7.2、通气量1.0 vvm、溶解氧浓度10%。该工艺经50 L发酵罐验证,平均发酵效价达14117 U·mL^(-1),产量较优化前提高18.8%,可用于规模化生产。

东方拟无枝酸菌发酵液小组分的分离鉴定

本文首次从万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌的发酵液中分离纯化出三个微量组分LYV09lx01、LYV09lx02、LYV09lx03。考察了摇瓶装量的影响,确定了适合LYV09lx01、LYV09lx02富集的摇瓶发酵条件。LYV09lx03则通过万古霉素水解来富集提取。经筛选获得一种具有特异性吸附作用的弱极性大孔吸附树脂AB-8,结合中压液相色谱及高效液相色谱技术进一步纯化鉴定得到一新结构的异黄酮苷。

内源性质粒pXL100的消除影响东方拟无枝酸菌HCCB10007中次级代谢产物的合成

目的利用分子手段获得东方拟无枝酸菌HCCB10007内源环型质粒pXL100消除突变株,探究大质粒pXL100对于HCCB10007次级代谢产物的影响。方法利用同源重组的方法将pXL100上疑似编码与质粒复制相关的基因orf37(par A)阻断,同时引入安普霉素抗性基因作为后续的筛选标记。通过EB诱导,影印培养筛选pXL100消除突变株。比较突变株与原始菌株生长及主要次级代谢产物的变化。结果通过筛选获得质粒消除突变株HCCB10007-pXL(-),其万古霉素和ECO-0501的产量较原始菌明显下降,分别为原菌株的1/4和1/100。结论东方拟无枝酸菌HCCB10007的质粒pXL100具有调控万古霉素和ECO-0501合成的基因。

Ca^(2+)和Cu^(2+)对东方拟无枝酸菌产生万古霉素的影响

在东方拟无枝酸菌发酵中加入CaCl2 ·2H2 O(4 0mg/L)或CuSO4·5H2 O(10mg/L)可分别提高万古霉素产量 12 %和 11% ,二者联合加入则有协同作用。Ca2 + 能使胞内万古霉素浓度降低 3 6% ,而Cu2 + 可使胞内TDP 葡萄糖 :糖苷配基万古霉素葡糖基转移酶的活性比对照增强 3倍。Ca2 + 的作用可能是改变细胞对万古霉素的渗透性 ,而Cu2 + 可增强万古霉素生物合成酶的活性。

东方拟无枝酸菌原生质体激光诱变选育

为了选育去甲基万古霉素高产菌,以东方拟无枝酸菌07-8-32为出发菌株,制作原生质体,经氦氖激光处理后分离。经过21批次的筛选得到的突变株08-8-48效价比出发株高27.3%,且菌丝状态、传代稳定性好。

bgtfA在东方拟无枝酸菌中异源表达及其产物鉴定

在万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)中异源表达Balhimycin产生菌来源的糖基转移酶基因bgtfA,从而在工程菌发酵液中获得杂合万古霉素,以探索糖基转移酶BgtfA能否作为一个独立的元件在异源宿主中发挥催化作用。首先将bgtfA基因克隆至载体质粒pULVK2AE,构建重组质粒pLYEBA2AE,然后采用电转化方法将质粒导入东方拟无枝酸菌,用HPLC和LC-MS检测、验证工程菌发酵液中是否存在BgtfA的催化产物。成功地在东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)异源表达bgtfA基因,经HPLC和LC-MS检测分析,在工程菌的发酵液中获得预期的BgtfA催化产物,杂合万古霉素LYV07ww01。这表明BgtfA有一定的底物宽泛性,不仅能够催化表万古糖胺与balhimycin苷元的连接,还能催化万古糖胺连接至万古苷元。

万古霉素产生菌的选育与发酵培养基优化

万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌 (Amycolatopsisorientalis) 5 13经紫外线 (3 0W ,2 5 3 7nm ,距离3 0cm ,照射 5 0s)诱变后 ,在含万古霉素 10 0 0 μg/ml的浓度梯度平板上筛选万古霉素抗性变株 ,得到一株万古霉素抗性变株A .orientalis 6 2 1,其摇瓶效价较出发菌株提高 2 3 % ,对万古霉素的抗性提高 2 0 0 %。传代试验表明该变株的高产性能遗传特性较稳定。用正交试验法对万古霉素发酵培养基进行了优化 ,与原发酵培养基相比 ,万古霉素的摇瓶发酵效价提高了 14 3 %。

链霉素抗性突变—万古霉素高产菌株的选育研究

以东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)AO-4为出发菌株,经紫外线(15w,253.7nm,距离30cm)诱变处理,筛选链霉素抗性突变株(链霉素浓度1000μg/ml),从中获得万古霉素高产变株AmycolatopsisorientalisAO-29,其发酵效价较出发菌株提高170%。传代实验表明该变株的高产性能遗传特性较稳定。

去甲万古霉素生产菌株Amycolatopsis orientalis遗传操作体系的建立

为了对去甲万古霉素高产菌中的功能基因进行研究，以整合型pZMW为载体，考察了去甲万古霉素生产菌东方拟无枝酸菌属间结合转移限制因素，优化3个关键限制因素：产孢培养基为YD，起始孢子量控制在1×10^8～4×10^8／反应，抗生素覆盖时间为16～17h为宜。建立了东方拟无枝酸菌生产菌株NCPC2-48的操作方法和培养条件，使体内分析该菌的生物合成及调控基因的功能成为可能，并为建立其他放线菌遗传操作体系提供了参考。

一株万古霉素产生菌的分离及育种

从厦门集美的土壤样品中分离了一株发酵产物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26003和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC(B)63501具有明显抑菌活性的放线菌菌株(XM0301).经形态、生理、生化鉴定和16S rDNA序列分析,为一株东方拟无枝酸菌(A mycolatopsis orientalis),高效液相色谱(HPLC)检测其发酵产生万古霉素.随后采用原生质体诱变和基因组改组提高其万古霉素的产量,经初筛、复筛获得万古霉素产量达到4 210μg/mL的高产突变株G2-73.

一株聚乙烯降解菌的筛选及其降解特性研究

为解决聚乙烯塑料在自然环境中难降解的问题,从土壤中分离出一株降解菌用于聚乙烯塑料生物降解研究。经筛选纯化,对该菌进行生理生化实验、16Sr DNA序列分析和系统发育进化树构建;将菌株接种于以不同相对分子质量聚乙烯粉末(相对分子质量分别为2000、5000、100 000)和膜片(相对分子质量>400 000)为唯一碳源的基础液体培养基中,于30℃、180 rpm下培养;采用分光光度法每隔24 h测定菌体生长浓度、总蛋白含量、还原糖含量以及p H值;培养14 d,采用ABTS法和愈创木酚法测定漆酶和锰过氧化物酶酶活力;培养60 d,称量聚乙烯残留物质量,于扫描电子显微镜下观察膜片表观,对膜片力学性能变化进行测定。鉴定结果表明,该菌为放线菌属的东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis);菌生长浓度随聚乙烯相对分子质量的增大而减小;胞外蛋白质量浓度为(27.625±0.400)^(0.958±0.180)μg·m L^(-1);还原糖质量浓度为(15.664±1.764)^(2.660±0.000)μg·m L^(-1);p H值显著下降;漆酶和锰过氧化物酶酶活力酶活力分别为3 500~3 000 U·L^(-1)和2 600~2 000 U·L^(-1);聚乙烯失重率为(35.81%±0.39%)^(5.57%±0.22%);电镜观察发现膜片表面出现大量降解孔洞和大面积菌体附着;膜片力学性能显著下降;亲水性增大,表面能增大。证明东方拟无枝酸菌能够直接作用于普通聚乙烯塑料表面,是一株高效的降解菌株。推测该菌通过分泌胞外酶氧化聚乙烯长烃链,降低聚乙烯表面能,且在降解过程中产生酸性物质,长烃链最终转化成小分子物质;在菌株降解聚乙烯中起直接作用的酶为漆酶和锰过氧化物酶。

ECO-0501产生菌的发酵条件优化

优化东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)dA9发酵制备ECO-0501的工艺条件,包括种龄、初始pH、培养温度、碳氮源种类等,并通过正交试验优化发酵培养基的组成。在30℃、种龄3d、接种量8%、发酵4d的条件下,摇瓶发酵单位达115mg/L,比优化前提高了约60%。