东方肉座菌EU7-22纤维素酶基因的克隆及序列分析

东方肉座菌EU7-22与XC-9、里氏木霉、康宁木霉、黑曲霉、斜卧青霉进行产纤维素酶比较,结果表明菌株EU7-22具有较高的产纤维素酶能力及完整的纤维素酶系。根据里氏木霉和绿色木霉的外切葡聚糖酶,内切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶相关基因序列,设计引物PCR扩增出菌株EU7-22 cbhⅠ、cbhⅡ、egⅠ、egⅡ及bglⅠ。基因序列经NCBI Blast分析表明,cbhⅠ与绿色木霉cbh1基因(FJ871063)同源性最高达99%;cbhⅡ与康宁木霉cbh2基因(DQ504304)同源性最高达99%;egⅠ与长枝木霉eg1基因(GU144298)同源性最高达99%;egⅡ与绿色木霉eg2基因(EF602036)同源性最高达99%;bglⅠ与菌株Trichodermasp.SSLbgl基因(FJ040193)同源性最高达100%。5种纤维素酶基因编码的相应氨基酸序列与其他木霉纤维素酶的氨基酸序列相似性也非常高。对上述纤维素酶基因编码的相应蛋白的分子量、等电点、N-糖基化位点、信号肽序列进行分析;对纤维素结合区及糖基水解酶家族特征结构区进行了定位;用SWISS-Model模拟了酶蛋白的三级结构。

东方肉座菌EU7-22木聚糖酶和木糖苷酶基因克隆及生物信息学研究

东方肉座菌EU7-22具有高产半纤维素酶的能力。根据已报道的同属里氏木霉及绿色木霉木聚糖酶,木糖苷酶相关基因序列,设计PCR引物扩增出东方肉座菌内切木聚糖酶(XYNⅠ,XYNⅡ)及β-木糖苷酶(β-BXL)基因。序列经NCBIBlast分析:东方肉座菌xynⅠ基因与里氏木霉xyn1基因(X69573.1)的同源性最高达到91%;xynⅡ基因与绿色木霉xyn2基因(EF079061)同源性最高达到93%;β-bxl基因与里氏木霉β-bxl1基因(Z69257.1)的同源性最高达到94%。生物信息学分析表明内切木聚糖酶Ⅰ和Ⅱ均属于糖基水解酶家族11,N末端前19个氨基酸均为信号肽。内切木聚糖酶Ⅰ分子量为24.13kD,等电点为7.87,含有3个糖基化位点;内切木聚糖酶Ⅱ分子量为24.44kD,等电点为4.86,含有1个糖基化位点;β-木糖苷酶属于糖基水解酶家族3,分子量为87.27kD,等电点为5.49,N末端前20个氨基酸为信号肽,含有8个糖基化位点。利用SWISS-Model对木聚糖酶,木糖苷酶蛋白质三级结构进行了预测和模拟。对木聚糖酶和木糖苷酶基因及其编码蛋白质的生物信息学分析,为进一步研究这些基因的表达与调控、构建高效利用纤维素组份的工程菌株奠定基础。

东方肉座菌GH10家族木聚糖酶基因的克隆及异源表达

木聚糖酶是降解半纤维素最主要的酶,对于开发可再生生物能源具有重要的应用价值。分别以东方肉座菌(Hypocrea orientalis)EU7-22的基因组DNA和c DNA为模板,利用染色体步移和PCR技术首次克隆获得该菌GH10家族木聚糖酶Ⅲ的基因(xynⅢ),并对其进行生物信息学分析。结果表明:该基因全长1283 bp(gxynⅢ),含有3个内含子;CDS序列为1044 bp(cxynⅢ),编码347个氨基酸,N端含有一个16 aa的信号肽序列;XYNⅢ氨基酸序列与Trichoderma pseudokoningii的endoxylanase具有较高的同源性。经生物信息学分析,XYNⅢ成熟蛋白可能含有18个N-糖基化位点,其理论等电点(p I)为6.14,蛋白质分子质量为36.55 ku,属于亲水性蛋白;SWISS-Model建模预测,XYNⅢ成熟蛋白中含有11个α螺旋,其核心结构为8个β折叠片围成一个柱状结构。同时将编码成熟蛋白的基因片段mxynⅢ与p PIC9K质粒连接构建表达载体后转化毕赤酵母,对重组子表达产物进行酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYNⅢ并分泌到胞外,发酵液中的木聚糖酶活在诱导培养168 h后可达到127.5 IU/m L。

乳酸对东方肉座菌β-葡萄糖苷酶的抑制动力学

为探讨糖化共发酵同步进行的过程中发酵产物对纤维素酶活力的影响,研究了乳酸对纤维素酶组分中β-葡萄糖苷酶(BG)活力的影响.结果显示:乳酸对BG活力有不同程度的抑制,该作用具有显著的浓度效应,其半抑制浓度IC_(50)=0.19mol/L;乳酸对BG的抑制类型是可逆的竞争性抑制,抑制常数K_I=0.149mol/L.应用底物反应动力学方法研究酶抑制动力学,建立了抑制动力学模型,发现乳酸对BG的影响是缓慢可逆失活的过程,底物对其有明显的保护作用,测得其正向速率常数k_(+0)为0.4L/(mol·min),逆向速率常数k-0为0.056min^(-1).该结果为纤维素糖化共发酵进程调控提供了理论依据.

转录调控因子BglR对东方肉座菌纤维素酶表达的影响

东方肉座菌(Trichoderma orientalis)EU7-22菌株是一株高效分泌纤维素酶的丝状真菌,对生物质转化具有重要价值.采用交错式热不对称PCR(TAIL-PCR)方法克隆得到纤维素酶转录调控因子bglr基因及其上下游序列,并经同源交换获得bglr基因敲除的菌株EU7-22Δbglr.其生产的滤纸酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶活力和分泌蛋白最高值较对照菌株分别增加了39%,22%,16%和20%,而β-葡萄糖苷酶活力下降47%,β-葡萄糖苷酶基因bgl1的表达量显著降低.进一步分析发现BglR的缺失抑制了菌株EU7-22在以特定多糖/寡糖为碳源的培养基上的生长,且引起发酵液pH值的改变.上述结果证明BglR对β-葡萄糖苷酶起正调控作用,可为构建高效降解纤维素的工程菌株提供参考.

东方肉座菌EU7-22纤维素内切酶Ⅰ的异源表达

[目的]实现东方肉座菌纤维素内切酶EGⅠ在毕赤酵母中的表达,获得重组EGⅠ。[方法]通过RT-PCR获得EGⅠ开放阅读框。将EGⅠ成熟肽和PHO1信号肽的DNA片段插入p PIC3. 5K后,重组表达载体电转化毕赤酵母。通过甲醇诱导表达和镍柱纯化获得EGⅠ。以羟甲基纤维素钠检测活性,以肽N-糖苷酶F分析N-糖基化,以SDSPAGE分析表达情况和糖基化修饰。[结果]获得EGⅠ分泌表达菌株,诱导96 h后上清液活性为0. 513±0. 002 U/m L,纯化后的EGⅠ活性为0. 558±0. 012 U/mg。SDS-PAGE表明EGⅠ分子量在100～180 k Da,远高于预测值47. 3k Da,经肽N-糖苷酶F处理后,降至63～75 k Da。[结论]实现了EGⅠ的分泌表达,获得活性为0. 558±0. 012 U/mg的糖基化重组EGⅠ。

β-葡萄糖苷酶的异源表达及与纤维素酶协同酶解竹纤维

在毕赤酵母GSll5中表达东方肉座菌EU7．22的B．葡萄糖苷酶基因（bglI），获得基因工程菌株BPl7。优化BPl7发酵产酶条件后，重组β－1葡萄糖苷酶活力达121IU／mL。酶学性质研究表明，该酶最适反应温度为70℃。在60％以下有较好的热稳定性；最适催化pH为5．0，在pH3．0～8．0之间有较好的稳定性。将异源表达的B．葡萄糖苷酶添加到东方肉座菌的纤维素酶液中协同降解经过预处理的竹纤维，当纤维素酶添加量为FPA20IU／g底物，β一葡萄糖苷酶添加量为BG6IU／g底物时，纤维二糖浓度显著下降，酶解得率达到83．03％，表明重组β－葡萄糖苷酶的加入更有利于纤维素的酶解糖化。

非特异性酶对壳聚糖降解效果的对比研究

采用非特异性酶(商品纤维素酶、商品木聚糖酶、东方肉座菌EU7-22和黑曲霉BE-2来源酶)分别降解壳聚糖,探索其降解的最佳工艺条件.结果发现4种非特异性酶最适pH值为5.5~5.7,最佳反应温度为45~55℃,底物质量浓度不宜高于15 g·L^-1;离子浓度对壳聚糖的酶解效率影响不大,可通过适当提高酶用量促进酶解.对比结果表明,通过东方肉座菌EU7-22可控发酵获得的非特异性酶能够在12 h内将壳聚糖降解为水溶性壳聚糖,效率远高于商品酶.

大米草半纤维素选择性酶解研究

采用由东方肉座菌EU7-22表达的重组木聚糖酶HoXyn11A、黑曲霉BE-2表达的重组木聚糖酶AnXyn10C和商品木聚糖酶分别降解大米草半纤维素,探索其降解的最佳工艺条件,结果发现该3种木聚糖酶最适pH值为4.5~5.5,最佳反应温度为45~55℃,酶用量为200~300 IU·g-1底物,反应时间为12~24 h.对比结果表明:通过黑曲霉BE-2表达的重组木聚糖AnXyn10C能够在24 h内基本将大米草半纤维素降解为低聚木糖,效率远高于商品酶和东方肉座菌EU7-22表达的重组木聚糖酶HoXyn11A.黑曲霉BE-2表达的重组木聚糖AnXyn10C是大米草半纤维素降解酶的良好来源.