抗东方马脑炎病毒结构蛋白E2单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗东方马脑炎病毒(EEEV)结构蛋白E2的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以Bac-to-Bac真核表达系统表达EEEV E2蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以原核表达载体pET-30a表达并纯化的EEEV E2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,获得4株稳定分泌抗EEEV E2蛋白MAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为6F3、6F11、7C11、8B11。Western blot与间接免疫荧光试验结果表明,获得的4株MAbs均与EEEV呈阳性反应,而与西方马脑炎病毒、乙型脑炎病毒以及登革热病毒1型～4型呈阴性反应。利用部分重叠的原核表达的短肽对E2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 6F11、7C11和8B11识别的抗原表位均为E-33(321EGLEYTWGNHPPKRVW336),而MAb 6F3无短肽与其反应,推测可能为构象表位。本研究结果为建立EEEV型特异性检测方法、研究E2蛋白结构功能及该病的进一步防制奠定了基础。

东方马脑炎病毒VLPs表达与免疫原性研究

目的表达东方马脑炎病毒(EEEV)病毒样粒子(VLPs),研究其免疫原性。方法采用PCR方法扩增目的基因,酶切之后连接到供体质粒pFastBacTM1上,构建成重组质粒pFastBacTM1-C-E,然后重组质粒经过基因重组作用与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)形成重组病毒BmNPV-C-E,BmNPV-C-E被转染到BmN细胞后以表达VLPs。VLPs鉴定表达正确后,用纯化VLPs与弗氏佐剂乳化成免疫原免疫小鼠,免疫剂量为15μg/只,免疫途径为后肢肌肉注射,免疫2次且间隔时间为14 d。2免后第7天检测免疫小鼠外周血中CD4+T细胞/CD8+T细胞比例和细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α含量,2免后第14天采用ELISA方法检测免疫小鼠血清内抗体IgG效价。结果研究结果显示实验组小鼠的CD4+T细胞/CD8+T细胞比例和细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α质量浓度与对照组相比差异均显著(P<0.01),免疫原实验组和VLPs免疫组2免后的血清效价分别为1∶128与1∶64,而对照组小鼠血清中没有产生IgG抗体。结论结果表明BmNPV-C-E能在BmN细胞中成功表达EEEV VLPs,并且VLPs能够刺激小鼠产生明显免疫反应,具有较强免疫原性,这为EEEV新型疫苗研究提供了重要参考。

我国一些地区人血清中抗辛德毕斯病毒和抗东方马脑炎病毒的抗体检测

我国一些地区人血清中抗辛德毕斯病毒和抗东方马脑炎病毒的抗体检测陈立，梁国栋，陈伯权，李其平，何英，宋立亭，赵子江，黄轶君（中国预防医学科学院病毒学研究所，北京１０００５２）辛德毕斯病毒（Ｓｉｎｄｂｉｓｖｉｒｕｓ）和东方马脑炎病毒（Ｅａｓｔｅｒｎｅｑｕ...

东方马脑炎病毒E2蛋白的表达、纯化及免疫原性

目的表达、纯化东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus,EEEV)E2蛋白,并检测其对小鼠的免疫原性。方法利用IPTG诱导重组大肠埃希菌BL21-pET30-EEEV-E2,表达E2蛋白,用包涵体纯化试剂盒纯化重组E2蛋白,进行SDS-PAGE和Western blot分析。将BALB/c小鼠随机分为4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组(弗氏佐剂与PBS按体积比1∶1乳化)、E2蛋白组(E2蛋白与PBS按体积比1∶1混合)和E2蛋白+弗氏佐剂组(E2蛋白与弗氏佐剂按体积比1∶1乳化),每组10只,各组均经小鼠后肢肌肉免疫3次,两次免疫间隔时间均为14 d,免疫剂量均为100μl/只。第2次免疫后第7天,采用流式细胞术检测小鼠体内CD4+和CD8+T细胞比例;第2次免疫后第14天,采用细胞因子ELISA定量试剂盒检测小鼠血清中IL-2、IL-4和IFNγ的含量;第3次免疫后第7天,采用MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖情况;每次免疫后第14天,采用ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体效价。结果表达的重组E2蛋白相对分子质量约为53 000,表达量为菌体总蛋白的26.3%;纯化的重组E2蛋白纯度达95%以上;表达和纯化的重组E2蛋白均可与鼠抗His标签单克隆抗体结合。与PBS对照组、弗氏佐剂对照组和E2蛋白组相比,E2蛋白+弗氏佐剂组小鼠体内CD4+与CD8+T细胞比值、血清中IL-2、IL-4和IFNγ浓度、体内淋巴细胞增殖指数均明显升高(P﹤0.01);小鼠初次免疫后即可产生E2蛋白IgG抗体,且随着免疫时间的延长,抗体效价逐渐上升,第3次免疫后第14天,抗体效价可达1∶320。结论表达并纯化了重组E2蛋白,其能使小鼠产生较强的免疫反应,为新型EEEV疫苗的研制提供了参考。

真核表达东方马脑炎病毒衣壳蛋白Capsid抑制IFNγ应答基因转录

目的克隆东方马脑炎病毒(EEEV)衣壳蛋白(Capsid)基因,构建其真核表达载体,检测该基因在293细胞中的表达,并初步研究其对干扰素(IFN)应答基因表达的影响。方法构建包含EEEV capsid基因的真核表达载体pcDNA3-Flag-capsid,以威格拉斯脂质体转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测其表达情况;应用定量PCR比较IFN效应基因Gbp1,Gbp2和Isg15在pcDNA3-Flag-capsid和空载体转染细胞中mRNA表达差异。结果构建了EEEV Capsid真核表达质粒,并且该质粒能够在293细胞中有效表达,同时定量PCR结果表明,与空载体转染对照组相比,外源导入EEEV Capsid抑制IFN应答基因Gbp1,Gbp2和Isg15的转录。结论真核表达EEEVCapsid抑制细胞内IFN应答基因的表达,为研究EEEV致病机制奠定基础。

东方马脑炎E2蛋白原核表达及免疫活性初步研究

为构建东方马脑炎病毒E2基因原核表达载体,完成E2蛋白表达及其免疫活性研究。利用PCR方法扩增E2编码全基因,大小为1 260 bp,将酶切后目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)上,构建成重组质粒pET30a(+)-EEEV-E2,采用酶切和测序分析方法鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,诱导E2蛋白表达,并用SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析和鉴定目的蛋白;最后,用纯化的E2蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠随机分成4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组、E2蛋白免疫组和E2蛋白+弗氏佐剂免疫组,每组小鼠免疫2次,两次免疫间隔时间为14天,免疫剂量均为100μL/只;小鼠初次免疫后第10天,用细胞因子ELISA试剂盒检测血清中IL-6、IL-12与TNF-α的浓度,加强免疫后第14天,用EEEV的假病毒检测血清中E2蛋白抗体的中和作用。结果表明完成了E2基因的原核表达载体pET30a(+)-E2构建和成功表达了带有His标签的E2融合蛋白,蛋白以包涵体形式存在,大小为53.0 kDa;免疫小鼠血清中产生了高水平的IL-6、IL-12与TNF-α和具有较强中和作用的E2蛋白抗体。研究结果为今后E2蛋白作为基因工程亚单位疫苗的研究提供了重要参考。

5种脑炎人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)5种人兽共患脑炎病病毒的多重RT-PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列设计特异引物,通过优化引物组合及PCR反应条件,建立可同时检测5种病毒的方法,扩增片段长度分别为411 bp(JEV)、945 bp(TBEV)、193 bp(EEEV)、545 bp(WEEV)和769 bp(CHIKV);该方法具有良好的特异性,对病毒核酸最低检测拷贝数分别为7.1×103、3.6×103、2.2×103、5.6×103和5.1×103。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,为以上5种人兽共患脑炎病病毒提供快速检测手段。

罗得岛发现携带EEE病毒的蚊虫

普罗维登斯消息:去年9月份在罗得岛东部发现了携带东方马脑炎病毒(EEE)的蚊子。沿马萨诸塞州边界以及在罗得岛西南角的查尔斯镇捕捉的蚊子经试验证明带有EFE病毒。Lincoln Almond关闭了一些海滩和野营区,并要求居民采取预防措施,如穿长袖衬衣和长裤,喷涂防虫剂,在蚊虫最活跃的时间(拂晓和傍晚)呆在室内等。有关人士还要求居民排去鸟槽、街沟等存水处的水,这些地方是蚊虫的孳生地。

人类EEEV病例与蚊子传播有关

美国疾病预防与控制中心（CDC）在“人类东方马脑炎病毒（EEEV）感染”的每周发病率和死亡率报道中强调了该病毒感染诊断学方面和防蚊措施方面的重要性：旅行相关性登革热病毒感染病例的出现强调了对于去热带疫区的旅行者应采取相似的措施：沙门氏菌的爆发流行与接触污染的宠物食物有关。

给妊娠母猪接种疫苗保护仔猪预防EEEV感染

美国F.Elvinger等人用市售抗东方马脑炎病毒(EEEV)疫苗接种的18头妊娠母猪血清和初乳中检出血清-病毒中和抗体(SVN),摄取初乳后,从几乎所有产于接种母猪的仔猪血清中检出抗体。测定了下次产仔时初乳和仔猪体内的SVN试验滴度并且在第三次产仔前再给母猪接种可使血清。