鲤肌肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的分子克隆(英文)

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)是最近发现的一种蛋白酶。该酶参与肌原纤维蛋白的降解及鱼糜制品弹性的下降。但是,对该酶一级结构的研究,迄今为止,未有报道。本文根据已测定的鲤MBSP N-末端氨基酸序列以及丝氨酸蛋白酶活性中心保守序列设计兼并引物,结合RT-PCR技术实现了MBSP基因片段的扩增。再根据克隆到的MBSP片段序列设计基因特异引物,用于MBSP基因的5′和3′末端快速扩增。综合以上结果,鲤MBSP的全长被确定。序列分析表明,MBSP cDNA含有一732 bp的开放阅读框,编码243个氨基酸残基,其中信号肽长度为21个氨基酸残基。组成丝氨酸蛋白酶活性中心的氨基酸残基(His61,Asp107和Ser197)在MBSP中保守存在。成熟MBSP含有222个氨基酸残基,分子量为24.5 ku,比其天然蛋白的分子量30 ku略小。成熟MBSP的等电点为10.43。鲤MBSP与鲫MBSP,猪胰蛋白酶,牛胰蛋白酶,美洲鲽胰蛋白酶的同源性分别为80.6%,55.8%,55.3%和53.9%。而与仓鼠肌肉中具有胰凝乳蛋白酶性质的蛋白酶的同源性为39.2%。MBSP有高含量的赖氨酸残基(11.93%),此特性可能与该酶的肌原纤维结合特性有关。

鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶研究进展

本文综述鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)的分离纯化、酶学特性、分子生物学及基因重组表达等方面的研究进展。鱼类MBSP是一种弱碱性蛋白酶,它普遍存在于鱼类肌肉中。MBSP降解肌原纤维蛋白是造成鱼糜凝胶劣化的主要原因。同时,由于鱼类MBSP具有良好的热稳定性及对精氨酸或赖氨酸残基羧基端特异分解的底物特异性,因此,该蛋白酶有望开发成为一种新颖的工具酶应用于蛋白质质谱鉴定等研究领域。

白鲢肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶单域抗体文本库构建及淘选

鱼肉中的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)在加工过程中可降解肌原纤维,引起鱼糜制品的凝胶劣化。一种新型特异性高的鲨源抗体——单域抗体(single-domain antib odies,sdAbs),能直接与抗原结合并抑制酶的活性。研究主要完成了针对MBSP单域抗体制备的前期工作:文本库建立及淘选过程,以克隆表达的MBSP为抗原免疫铰口鲨鱼(nurse shark,Ginglymostoma cirratum),构建鲨鱼单域抗体文本库,并从中淘选针对MBSP的特异性单域抗体噬菌粒,最终得到31个能与MBSP特异性结合的噬菌粒,为获得抗MBSP单域抗体鉴定了基础,以期抑制或消除MBSP的活性,解决现有鱼糜制品凝胶劣化的问题。

鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的结构建模、内源抑制剂对接及其钙结合机制

【目的】分析鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(Myofibril-bound serine proteinase,MBSP)结构的基础特性。【方法】使用AlphaFold2对鲢MBSP进行结构建模,通过保守性分析、静电势计算、分子对接等手段探讨鲢鱼MBSP的结构特征,并借助分子动力学模拟研究钙结合对其结构的影响。【结果与结论】鲢鱼MBSP的活性酶形式含222个残基,有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的典型结构特征,但表面充斥着更多赖氨酸,使其表面“粗糙”且利于离子键形成。62Asn及61Glu是其关键的钙结合位点,钙结合导致的结构变动可传至C端,40His、自溶环、氧阴离子稳定环等关键区域的柔性变化是钙激活机制中的重要部分。葡萄糖-6-磷酸异构酶二聚体上的10Arg及17Lys是参与鲢鱼MBSP底物结合竞争的潜在关键位点。除催化活性口袋外,潜在的变构位点亦是MBSP抑制剂设计的可选出发点。

草鱼丝氨酸蛋白粗酶的提取、酶学特性及大豆胰蛋白酶抑制剂对其活性的影响

【目的】探究草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)粗酶的提取方法、酶学特性,以及大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对草鱼鱼糜凝胶品质的影响,为改善传统草鱼鱼糜制品品质提供理论基础。【方法】从草鱼背肌中提取MBSP粗酶液,探究提取过程中漂洗次数(1~5次)、热处理温度(35、40、45、50、55℃)、酸洗脱pH值(pH 4.0、pH 5.5)对提取液酶活性的影响,获得最佳提取条件;设置梯度实验探究所得酶的最适温度、pH、稳定性等酶学特性,最后探究大豆胰蛋白酶抑制剂对粗酶酶活性的影响及其对草鱼鱼糜凝胶性能的调控。【结果及结论】经3次漂洗、45℃热处理、pH 4.0酸洗脱后得到的草鱼MBSP粗酶液酶活性最高(P<0.05);所得MBSP最适pH值在9.0附近,最适温度为45℃,具有较好的温度稳定性(P<0.05),其活性可被Na^(+)在一定程度上抑制且被K+、Ca^(2+)激活(P<0.05);STI添加可以显著改善草鱼鱼糜质构,其对草鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶有可逆竞争性抑制作用,半抑制质量浓度为10.85μg/mL,抑制常数Ki=0.24μmol/L。

导电纤维和抗静电纤维的区别

一、前言随着合成纤维工业的迅猛发展,合成纤维在整个纺织纤维中占的比例越来越大,其织物已被广泛地应用在民用服饰、装饰织物、产业用工作服面料中。但常见的合成纤维存在着一个问题,就是易产生和积聚静电。

黄鳍鲷肌肉中肌联蛋白的纯化、抗体制备与性质分析

以黄鳍鲷为研究对象,经过低温抽提、凝胶过滤等方法从黄鳍鲷肌肉中分离纯化到肌联蛋白(Titin)。免疫斑点印迹法(dot-blot)检测结果显示,纯化蛋白与小鼠抗鸡肌联蛋白单克隆抗体产生特异性反应。55℃条件下,以肌原纤维蛋白和纯化后肌联蛋白为底物进行分解结果显示,肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)对肌联蛋白有明显的分解作用。

内源性蛋白酶对鱼糜凝胶的影响及其抑制方法研究进展

鱼肉中的内源性蛋白酶是造成鱼糜凝胶劣化,影响鱼糜质构特性的主要内在原因。添加内源性蛋白酶抑制剂是控制鱼糜凝胶劣化常用的方法。本文综述了鱼肉中三种主要内源性蛋白酶(钙蛋白酶、组织蛋白酶和肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶)的性质及其对鱼糜凝胶特性的影响,并总结抑制内源性蛋白酶引起的鱼糜凝胶劣化和其他改善鱼糜凝胶特性的方法,旨在为控制鱼糜凝胶劣化及改善鱼糜凝胶特性提供理论依据。

电子束辐照对带鱼鱼糜内源性蛋白酶活性及其构象单元的影响

鱼类内源性蛋白酶是引起鱼糜凝胶劣化的重要因素之一。以不同剂量电子束辐照带鱼鱼糜,测定鱼糜内源性肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)和组织蛋白酶L(cathepsin L,Cat-L)活力及其最适反应温度,结合圆二色光谱分析其构象单元变化,探讨电子束辐照对鱼糜内源性MBSP和Cat-L的影响。结果表明:随着辐照剂量的增加,鱼糜MBSP和Cat-L活力降低,当辐照剂量为9 kGy时Cat-L活力下降更为明显;对照组和辐照组鱼糜MBSP的最适温度均为55℃,但3 kGy及9 kGy辐照对Cat-L的最适温度产生影响,使其由55℃降低至45℃;辐照引起鱼糜MBSP和Cat-L分子中的二级结构单元互相转化,导致其构象变化,削弱其降解肌原纤维蛋白的能力。结论:电子束辐照能够影响带鱼鱼糜MBSP和Cat-L的二级结构及活力,减轻二者对肌原纤维蛋白的降解作用,适宜剂量的电子束辐照能有效抑制鱼糜内源性蛋白酶活性,防止凝胶劣化,有利于鱼糜凝胶的形成。

鲫鱼MBSP的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)的原核表达菌株Rosetta(pET28aMBSP),获得重组MBSP,以制备MBSP多克隆抗体。将鲫鱼MBSP全长基因(MBSP)借助表达载体pET-28a构建重组表达菌株Rosetta(pET28a-MBSP),并进行诱导表达后获得重组MBSP。利用Ni-NTA agarose亲和层析柱纯化重组蛋白并进行质谱鉴定。以纯化后的重组MBSP作为抗原免疫新西兰兔,获得MBSP多克隆抗体。分别采用ELISA和Western blot技术测定其效价和特异性。诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析、Western blot检测及质谱鉴定,结果表明该蛋白质为重组MBSP,其相对分子质量约为28×10~3,与天然MBSP大小一致,主要以包涵体形式存在。将其免疫兔子后,从血清中获得了与MBSP发生特异性反应的高效价多克隆抗体。本研究中成功表达和纯化了重组MBSP蛋白,制备了高效价的特异性MBSP多克隆抗体,为MBSP的相关研究奠定基础。