犬恶丝虫病ELISA诊断方法的建立

目的建立犬恶丝虫病的ELISA诊断方法。方法将犬恶丝虫成虫粗制抗原经过SephaexG-200凝胶柱层析后进行间接ELISA试验,确定最佳实验条件,建立犬恶丝虫病的同种纯化抗原ELISA诊断法。通过阻断性试验、交叉反应试验、敏感性和特异性试验、重复性试验及与病原学方法比较,评价其效果。结果纯化抗原ELISA方法与犬钩虫和蛔虫感染犬血清无交叉反应,检出的阳性血清最高抗体滴度为1∶25600,重复性好。结论成功建立犬恶丝虫病ELISA诊断方法,可替代虫检法对犬恶丝虫病进行早期诊断。

犬恶丝虫酪蛋白激酶2β亚基基因片段的克隆和原核表达

目的对犬恶丝虫酪蛋白激酶2β亚基(Csnk2b)部分基因片段进行克隆、原核表达及免疫反应性分析。方法根据犬恶丝虫cDNA文库中筛选出的Csnk2b部分基因片段设计引物,以含有插入Csnk2b部分基因片段的噬菌体DNA为模板,进行PCR扩增。产物亚克隆至原核表达载体,构建重组载体pGEX-4T-1-Csnk2b,双酶切鉴定。将其转入大肠埃希菌(E.coli)Rosetta(DE3)中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达的重组蛋白,蛋白质印迹(Western blotting)以小鼠抗犬恶丝虫阳性血清为一抗,分析重组蛋白免疫反应性。结果Csnk2b部分基因片段PCR扩增产物约为700 bp,测序结果与cDNA文库中筛选得到的序列一致。重组表达载体pGEX-4T-1-Csnk2b双酶切鉴定正确。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导后重组蛋白GST-Csnk2b表达,相对分子质量(M r)约为45 000,与预期大小一致。Western blotting分析表明,重组蛋白能被小鼠抗犬恶丝虫阳性血清识别。结论克隆并表达了犬恶丝虫Csnk2b重组蛋白,且该蛋白具有免疫反应性。

犬恶丝虫硫氧还蛋白过氧化物酶真核表达质粒的构建及初步免疫试验

为评价犬恶丝虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)真核表达质粒的免疫原性,本实验利用RT-PCR方法扩增TPx基因,将其克隆于真核表达载体pVAX1中构建重组质粒pVAX1-TPx,并对其进行体外表达鉴定及通过特异性抗体水平及相关的免疫因子的检测,评价其在体内诱导的免疫反应。实验结果表明,将pVAX1-TPx转染于Cos7细胞中能够正确表达TPx,其分子量约为28 ku,并被阳性血清所识别。将pVAX1-TPx免疫BALB/c小鼠并采用ELISA检测结果显示,重组质粒免疫组的外周血中抗体、Th2细胞分泌的IL4及IL13细胞因子水平均显著高于空质粒及空白对照组(p<0.05);但Th1分泌的IFN-γ及IL2水平差异不显著。此外,淋巴细胞增殖试验结果也表明,pVAX1-TPx免疫组显著高于其他两个对照组(p<0.05)。实验数据表明pVAX1-TPx免疫可以有效诱导特异性的体液和细胞免疫。

成都动物园野生动物原虫和犬恶丝虫的感染情况调查

对2006-2008年先后采集自成都动物园30种177只野生动物的血样进行了弓形虫、犬新孢子虫和犬恶丝虫血清抗体的检测。结果显示，弓形虫抗体阳性率为47.46％（84／177）；犬新孢子虫抗体阳性率为10.74％（19／177）；犬恶丝虫抗体阳性率为2.26％（4／177）。同时，对该动物园30种187只野生动物的血样进行了血液涂片染色镜检，附红细胞体检出率为35.83％（67／187），在血涂片中未查出伊氏锥虫。

犬恶丝虫抗体dot-ELISA检测方法的建立

为快速诊断犬恶丝虫病,建立了犬恶丝虫抗体dot-ELISA检测方法,并与阻断试验、交叉反应试验、重复性试验、琼脂扩散试验和平行对照试验进行了比较。结果显示,制备的犬恶丝虫虫体粗制抗原与犬钩虫、犬弓首蛔虫和犬蠕形螨感染犬的阳性血清无交叉反应,检出犬恶丝虫阳性血清的最高抗体效价为1∶1 024,重复性好;建立的犬恶丝虫病dot-ELISA诊断方法的灵敏度比琼脂扩散试验和美国IDEXX实验室制备的犬恶丝虫病诊断试剂盒分别高2 048倍和48倍。

犬恶丝虫病病原生物学研究进展

从虫体的分类、分布、宿主、发育生物学和内共生体等几个方面综述了近年来在犬恶丝虫病病原生物学研究上取得成果,并提出了研究该病病原的现实意义和今后研究的主要方向。

犬恶丝虫病的诊断和防治研究进展

犬恶丝虫病作为一种重要的人兽共患病,对伴侣动物、野生动物危害严重。作者综述了近年来在犬恶丝虫病的诊断和防治上取得的系列成果;并指出了该病今后诊断的发展方向和防治重点。

丹东地区犬恶丝虫病的血清流行病学调查

本调查首次应用犬恶丝虫同种纯化抗原进行ELISA检测对辽宁省丹东地区12个品种,1048条不同年龄、不同饲养条件的犬进行犬恶丝虫的血清流行病学调查,同时与虫检法进行比较。结果表明:丹东地区犬恶丝虫的血清阳性率为28.5%,虫检的阳性率为22.6%。虫检法阳性犬的检测结果与ELISA法一致,且ELISA法的检出率高于虫检法。此外,调查结果还表明:犬恶丝虫的感染率与犬的品种、性别无关;与犬的饲养条件及年龄有关。ELISA法在丹东地区犬恶丝虫病的血清流行病学调查中的应用,有效地提高了该病的检出率,为该地区对犬恶丝虫病的早期预防和治疗提供了有力依据。

犬恶丝虫病的诊治

犬恶丝虫病（Dirofilariasis）是由犬恶丝虫成虫（Dirofilariaimmitis）寄生于犬的右心室、肺动脉内，导致犬循环系统、呼吸系统和泌尿系统等遭受损害而发生的血液寄生性线虫病。该病不仅严重威胁养犬业的发展，甚至危害人类健康。在一些国家，

匐行恶丝虫(Dirofilaria repens)在我国犬体内首次发现

1987年1月,于哈尔滨市万宝乡的成年犬背部皮下组织中发现珍条淡黄色的丝状线虫。经显微镜下观察和量度,确定为旬行恶丝虫Dirofilaria repens Raillet et Her-ny,1911的雌虫。

寄生在北极狐心脏中的犬恶丝虫及其防治

首次报道了犬恶丝虫（Dirofilara.Lmmifis）在笼养北极狐（AlopexLagopus）心脏中的寄生，简述了其形态、生活史、致病力，诊断及其防治。北极狐为本线虫的新宿主。

犬恶丝虫硫氧还蛋白过氧化物酶真核表达质粒的构建及初步免疫试验

为评价犬恶丝虫硫氧还蛋白过氧化物酶（TPx）真核表达质粒的免疫原性，本实验利用RT—PCR方法扩增TPx基因，将其克隆于真核表达载体pvAxloe构建重组质粒pVAXI—TPx，并对其进行体外表达鉴定及通过特异性抗体水平及相关的免疫因子的检测，评价其在体内诱导的免疫反应。

应用ITS-2基因对小熊猫源恶丝虫虫种的鉴定

为探讨采自小熊猫的恶丝虫虫种的分类地位,测定了四川雅安地区犬源犬恶丝虫和成都及重庆两地小熊猫源恶丝虫的核糖体第二内转录间隔区（ITS-2）基因序列并进行了比对分析。结果显示,犬源犬恶丝虫和小熊猫源恶丝虫与来自中国台湾、印度的犬恶丝虫的ITS-2基因序列的同源性高达98.0%-100%。同时,构建的NJ树和MP树均显示不同宿主和不同地区的犬恶丝虫和小熊猫源恶丝虫聚类形成一个支系。表明,小熊猫源恶丝虫应为犬恶丝虫,而前苏联学者定名的小熊猫恶丝虫应为犬恶丝虫的同物异名虫种。

犬恶丝虫病的药物治疗效果研究

本试验对24头恶丝虫病阳性犬的成虫选用硫砷酰胺钠进行驱杀,60d后再用左旋咪唑对幼虫进行驱杀,并设对照组。结果5个月后只有1头犬呈阳性;10个月后再次用ELISA检测,对照组有2头呈阳性,试验组仅1头呈阳性。表明硫砷胺酰胺钠杀灭犬恶丝虫成虫的效果比较好,有效率高达95%,但不能杀灭幼虫;左旋咪唑在该使用条件下能够有效杀灭幼虫。

犬恶丝虫天冬氨酸转氨酶基因的原核表达及分析

目的了解犬恶丝虫天冬氨酸转氨酶(AspAT)基因特征及其在虫体的定位,对犬恶丝虫AspAT(DiAspAT)基因进行了原核表达和免疫荧光定位分析。方法从犬恶丝虫成虫转录组数据库中筛选到DiAspAT基因序列,通过RT-PCR方法克隆DiAspAT基因,利用相关软件进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET32a(+)-AspAT并进行诱导表达;表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后进行Western blotting分析;通过免疫组化技术观察DiAspAT蛋白在犬恶丝虫虫体内的定位分布。结果 DiAspAT基因的ORF框长度为1 221bp,编码406个氨基酸,理论相对分子量45.731 8kDa,等电点为8.05,表达的重组蛋白约为64kDa;Western blotting显示AspAT重组蛋白能被犬恶丝虫阳性血清识别;间接免疫荧光染色结果显示,DiAspAT在犬恶丝虫的侧索、皮下组织、肌细胞、假体腔壁、子宫及肠上皮、发育的胚胎中分布。结论成功克隆和表达了DiAspAT基因,并完成DiAspAT在雌性犬恶丝虫成虫上的定位,为进一步了解犬恶丝虫的生理代谢及犬恶丝虫病的诊断和防控奠定基础。

犬恶丝虫核苷二磷酸激酶(NDPK)基因的原核表达及其免疫荧光定位

对犬恶丝虫核苷二磷酸激酶(NDPK)基因的基本特征进行探究,并评估其诊断价值,旨在为犬恶丝虫病的诊断提供依据。本研究原核表达了Di-NDPK,通过生物信息学、免疫印迹和免疫荧光组化分析了该蛋白的基本特征,通过检测犬恶丝虫阳性血清评估了rDi-NDPK的诊断价值。免疫印迹显示,Di-NDPK具有良好的反应原性,免疫荧光组化显示,Di-NDPK在犬恶丝虫的侧索及肠上皮细胞和肠腔中分布。间接ELISA显示,该方法的敏感性为66.7%(16/24),特异性为38.9%(14/36),其中与犬细粒棘球蚴病阳性血清、犬钩虫病阳性血清以及犬弓首蛔虫病阳性血清发生交叉反应。Di-NDPK是一个分泌蛋白,但不适合作为犬恶丝虫病的诊断候选抗原。

犬恶丝虫丝氨酸蛋白酶抑制剂特性分析与诊断价值的初步评价

为探究犬恶丝虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Di-Serpin)的生物学特性,初步评价重组蛋白(rDi-Serpin)的诊断价值。本研究扩增犬恶丝虫的Di-Serpin基因片段并经原核表达系统表达该蛋白,经western blot和免疫荧光定位分析r Di-Serpin的免疫反应性以及Di-Serpin在虫体的分布;以纯化的r Di-Serpin为包被抗原,通过间接ELISA评价其诊断价值。结果显示,Di-Serpin基因片段共编码121个氨基酸,预测蛋白质分子量为13.56 ku,等电点为5.06,含有一个Serpin结构域;Di-Serpin主要分布于犬恶丝虫(雌虫、雄虫)的表皮层和肠上皮;以其为包被抗原建立的间接ELISA方法,结果显示:该方法的敏感性和特异性检测结果分别为70%(14/20)和70%(35/50)。研究结果表明,犬恶丝虫的Di-Serpin可能为分泌蛋白,在抑制宿主蛋白酶活性,参与抗炎及逃避宿主对虫体的免疫中起重要作用;该蛋白虽有较好的免疫反应性,但其特异性和敏感性均较低,不适合作为犬恶丝虫病的候选诊断抗原。