雷公藤甲素通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β通路对MGC803细胞增殖、侵袭与迁移的影响

目的 探讨雷公藤甲素通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β(AKT/GSK-3β)通路对MGC803细胞增殖、侵袭与迁移的影响。方法 体外培养MGC803细胞,确定雷公藤甲素的干预剂量和干预时间。将细胞分为阴性对照组(A组,不进行处理),阳性对照组(B组,10μmol/L顺铂),雷公藤甲素高、中、低剂量组(C组、D组、E组)。干预48 h,采用Transwell法检测细胞侵袭能力,采用划痕试验法检测迁移能力,采用免疫印迹(Western blot)法检测检测相关蛋白的表达。结果 随着雷公藤甲素浓度的增加,MGC803细胞增殖率降低(P <0.05);48 h时半数抑制浓度(IC50)最小,选择干预时间为48 h,C组、D组、E组的干预剂量分别为80,40,20 nmol/L。与B组比较,C组、D组、E组侵袭细胞数、细胞迁移距离及波形蛋白(vimentin),snail,p-AKT/AKT,p-GSK-3β/GSK-3β表达水平均显著升高(P <0.05),上皮钙黏素(E-cadherin)、β-联蛋白(β-catenin)表达水平均显著降低(P <0.05),且呈剂量依赖关系。结论 雷公藤甲素可通过抑制AKT/GSK-3β信号通路而抑制MGC803细胞增殖、侵袭与迁移。

汉黄芩素调节磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/核因子κB信号通路对慢性阻塞性肺疾病大鼠辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的影响

目的探讨汉黄芩素(Wog)调节磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)/核因子κB(NF-κB)信号通路对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)平衡的影响。方法2022年8-12月,大鼠采用随机数字表法分为Model组、低剂量Wog组(Wog-L组,50 mg/kg)、高剂量Wog组(Wog-H组,100 mg/kg)、阳性药物氨茶碱组(Ami组,2.3 mg/kg)、IGF-1(PI3K激活剂)组(1.33 mg/kg)、Wog-H+IGF-1组(100 mg/kg+1.33 mg/kg)、对照组(CK组),每组12只。除CK组外,其他组大鼠均需利用烟熏法联合气管滴注脂多糖(LPS)的方法构建COPD模型,建模成功24 h后,进行给药处理,每天1次给药,持续4周。检测呼气峰流量(PEF)、每分钟通气量(MV)、吸气峰流量(PIF);流式细胞术检测外周血中Th17/Treg;HE染色检测肺组织病理;酶联免疫吸附法检测大鼠肺组织中白细胞介素(IL)-17、IL-10水平;蛋白质印迹法检测肺组织中维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)、叉头框蛋白P3(Foxp3)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白。结果与CK组比较,Model组大鼠PEF(12.56±0.47比8.72±0.39)、PIF(9.35±0.32比7.24±0.17)、MV(132.26±5.78比96.63±3.28)、Treg(31.18±2.62比15.52±1.01)比例、IL-10(23.35±1.16比8.85±0.27)明显降低(均P<0.05);Th17(3.14±0.13比18.86±1.67)比例、Th17/Treg(0.10±0.01比1.22±0.11)、肺泡间隔(33.36±1.48比49.78±1.73)、气道炎症评分(0比4.56±0.23)及IL-17(75.83±3.60比185.56±8.62)水平明显升高(均P<0.05)。与Model组比较,Wog-L组、Wog-H组PEF(9.66±0.40,11.49±0.51)、PIF(8.28±0.19,9.03±0.22)、MV(105.54±4.11,126.67±5.72)、Treg(19.93±1.18,27.73±2.05)比例、IL-10(11.56±0.33,20.72±0.59)水平明显升高(均P<0.05);Th17(3.14±0.13比18.86±1.67)比例、Th17/Treg(0.10±0.01比1.22±0.11)、肺泡间隔(43.45±1.26,35.78±1.12)、气道炎症评分(3.75±0.17,0.86±0.07)、IL-17(162.27±7.14,103.35±4.33)水平明显降低(均P<0.05)。与CK组比较,Model组大鼠RORγt(0.15±0.01比1.34±0.11)、p-PI3K(0.22±0.01比0.86±0.07)、p-Akt(0.18±0.01比0.75±0.06)、p-NF-κB p65(0.11±0.01比0.69±0.06)蛋白表达升高,Foxp3(1.45±0.27比0.35±0.02)蛋白表达降低(均P<0.05)。与Model组相比,Wog-L组、Wog-H组RORγt(1.08±0.10,0.36±0.02)、p-PI3K(0.71±0.06,0.35±0.03)、p-Akt(0.62±0.06,0.28±0.02)、p-NF-κB p65(0.52±0.05,0.26±0.02)蛋白表达明显降低,Foxp3(0.57±0.04,1.13±0.09)蛋白表达明显升高(均P<0.05)。Wog-H组与Ami组大鼠上述各指标水平近似,均差异无统计学意义(P>0.05)。IGF-1逆转了高剂量Wog对COPD大鼠Th17/Treg的影响。结论Wog促进COPD大鼠Th17/Treg平衡的机制可能与下调PI3K/Akt/NF-κB通路有关。

辛开苦降法对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗患者卵巢功能、子宫内膜容受性及磷脂酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的 观察辛开苦降法对多囊卵巢综合征(Polycystic ovarian syndrome,PCOS)胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)患者卵巢功能、子宫内膜容受性及磷脂酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase/serine threonine protein kinase,PI3K/AKT)通路的影响。方法 选取2018年11月—2020年1月期间四川中医药高等专科学校附属绵阳市中医医院收治的PCOS-IR患者83例,按随机数字表法分为对照组41例和治疗组42例。对照组采用炔雌醇环丙孕酮联合二甲双胍治疗,治疗组采用中医辛开苦降法(中药),均连续治疗12周。观察比较两组患者治疗前后体质量指数(Body mass index,BMI)、卵巢功能[卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)、LH/FSH与抗缪勒管激素(Anti-mullerian hormone,AMH)]、血糖[空腹胰岛素(Fasting insulin,FIN)、空腹血糖(Fasting blood glucose,FPG)、餐后2 h血糖(2 hours postprandial blood glucose,2 h PBG)与胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessmentinsulin resistance,HOMA-IR)]、子宫内膜容受性[收缩期峰值流速(Vmax)、搏动指数(Pulse index,PI)、阻力指数(Resistance index,RI)、血流参数血管化指数(Vascularity index,VI)、血流指数(Flow index,FI)与血管化血流指数(Vascularity flow index,VFI)]、外周血PI3K/AKT通路(PI3K、AKT mNRA),治疗期间不良反应情况。结果 治疗后两组患者BMI、FPG、FIN、2 h GLU、HOMA-IR水平均较治疗前明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);且治疗组BMI、FPG、FIN、2 h GLU、HOMA-IR水平均明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后两组患者AMH、LH、LH/FSH水平均较治疗前降低,差异有统计学意义(P<0.05);FSH较治疗前无显著变化,差异无统计意义(P>0.05);且治疗组AMH、LH、LH/FSH明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后两组患者子宫内膜厚度、子宫容积、Vmax、VI、FI、VFI均较治疗前明显升高,PI、RI均较治疗前降低,差异有统计学意义(P<0.05);且治疗组子宫内膜厚度、子宫容积、Vmax、VI、FI、VFI均明显高于对照组,PI、RI均明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后两组患者PI3K、AktmRN表达均较治疗前升高,差异有统计学意义(P<0.05);且治疗组PI3K、AktmRN表达均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗期间,两组患者均未发生严重不良反应。结论 中医辛开苦降法不仅能改善PCOS-IR患者胰岛素抵抗,还可改善其卵巢功能、子宫内膜容受性,激活PI3K/AKT通路,安全性高。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11在泛癌的发生和预后中的作用及免疫分析

目的探讨丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11(STK11)在各种肿瘤中的潜在免疫功能和预后价值,为肿瘤的免疫治疗和预后提供依据。方法从TCGA、CCLE和GTEx数据库获取正常组织、肿瘤细胞和肿瘤组织中STK11基因的表达水平,采用R软件、Kaplan-Meier方法和对数秩检验分析STK11表达水平与预后的相关性,ESTIMATE算法计算每个肿瘤样品的免疫评分、基质评分和综合评分,R软件分析STK11表达与这些评分之间的关系。结果STK11在胆管癌、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肺鳞癌、胰腺癌和直肠腺癌中高表达,而在宫颈癌和子宫肉瘤等16种肿瘤中低表达;其表达水平与肝细胞癌和子宫内膜癌等7种肿瘤总体生存期显著相关,可作为预后指标。STK11表达水平在多形胶质母细胞瘤和肺腺癌等6种肿瘤中与免疫评分、基质评分和综合评分呈显著负相关,且与肝细胞癌和肺腺癌等部分肿瘤的免疫浸润密切相关。结论STK11基因在不同类型肿瘤中的表达有差异性(6种肿瘤中高表达,16种肿瘤中低表达),且与部分肿瘤免疫浸润相关,可作为预后指标。

环状RNA丝氨酸/苏氨酸蛋白扰动样激酶1和微小RNA-214在缺血性脑卒中病人中的表达及意义

目的 探究环状RNA丝氨酸/苏氨酸蛋白扰动样激酶1(Circ TLK1)和微小RNA(miR)-214在缺血性脑卒中(IS)病人中的表达及意义。方法 选取2019年4月至2021年4月在广元市中心医院治疗的97例IS病人为观察组,根据美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分将IS病人分为轻度组33例、中度组45例、重度组19例,另选取85例健康体检者为健康组。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测所有病人血清Circ TLK1和miR-214水平。对IS病人进行90 d的预后随访,按照改良Rankin量表(mRS)分为预后良好组和预后不良组,分析并比较不同预后病人的临床指标。多因素logistic回归分析IS病人预后不良的影响因素。受试者操作特征曲线(ROC曲线)分析Circ TLK1和miR-214对IS病人预后的预测价值。结果与健康组相比,观察组血清Circ TLK1[(1.83±0.22)比(1.03±0.12)]和miR-214[(2.64±0.49)比(1.07±0.13)]均显著性上调(P<0.05)。与轻度组相比,中度组和重度组病人血清Circ TLK1和miR-214均显著性上调,与中度组相比,重度组病人血清Circ TLK1和miR-214水平显著上升(P<0.05)。观察组病人90 d预后随访结果显示,预后良好组病人63例,预后不良组病人34例。两组病人同型半胱氨酸(Hcy)、三酰甘油、梗死体积、发病到住院的时间、入院时NIHSS评分、Circ TLK1、miR-214水平之间差异有统计学意义(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示,入院时NIHSS评分高、发病到住院的时间长、Circ TLK1、miR-214高水平是IS病人预后不良的独立危险因素(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,Circ TLK1和miR-214对IS病人预后评估价值的曲线下面积(AUC)分别为0.86、0.83,灵敏度分别为91.20%、67.60%,特异度分别为74.60%、90.50%。结论 Circ TLK1和miR-214在IS病人血清中呈高表达,二者是IS病人预后不良的独立危险因素,对病人的预后具有一定的评估价值。

意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本鉴定及验证

【目的】利用前期获得的高质量纳米孔长读段测序数据对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本进行鉴定和分析,为深入开展功能研究提供参考信息和基础。【方法】基于前期获得的高质量意大利蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过Blast工具将意大利蜜蜂全长转录本比对Nr数据库筛选出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本;利用gffcompare软件将筛选出的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶全长转录本与西方蜜蜂A.mellifera参考基因组(Amel_HAv3.1)上注释的转录本进行比较,以鉴定未注释的新基因和新转录本;使用Astalavista软件鉴定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的可变剪接(alternative splicing,AS)事件类型,采用IGV浏览器对剪接体的结构进行可视化,通过RT-PCR验证随机选取的6次AS事件的真实性。【结果】共鉴定到意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶71个基因和335条全长转录本,发掘出未注释的1个新基因和97条新转录本;共对14个已注释基因进行了结构优化,分别延伸了6个基因的5′端和8个基因的3′端。共鉴定到意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶7个基因的57次AS事件,包括40次外显子跳跃(exon skipping,ES)事件、15次可变5′端剪接位点(alternative 5′splicing site,A5SS)事件和2次可变3′端剪接位点(alternative 3′splicing site,A3SS)事件。对随机选取的6次AS事件的RT-PCR结果表明,所有目的片段均符合预期大小,证实了AS事件的真实性。【结论】本研究系统鉴定了意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本,优化了西方蜜蜂参考基因组注释的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的基因结构。

磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B信号通路在呼吸道过敏性疾病中对嗜酸性粒细胞的作用研究进展

近年来,呼吸道过敏性疾病已成为全球性疾病,尤其是变应性鼻炎和哮喘。嗜酸性粒细胞及其释放的炎症介质的作用是呼吸道过敏性疾病的主要发病机制。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(Akt)信号通路对细胞的存活、增殖、生长和代谢有多效性作用,也影响着炎症反应的进程。针对PI3K/Akt信号通路在呼吸道过敏性疾病中对嗜酸性粒细胞作用的研究,有助于明确呼吸道过敏性疾病的发病机制。本文就PI3K/Akt信号通路在呼吸道过敏性疾病中嗜酸性粒细胞的作用研究进展进行综述,以期对临床治疗呼吸道过敏性疾病提供理论参考。

前列腺癌中丝氨酸苏氨酸激酶-1和驱动蛋白-5蛋白表达及相关性研究

目的:检测前列腺癌中丝氨酸苏氨酸激酶-1(PIM-1)和驱动蛋白-5(Eg5)蛋白表达,探讨其表达与前列腺癌临床病理及它们之间的相关性。方法:采用免疫组化SP法检测81例前列腺癌和43例前列腺增生组织中PIM-1和Eg5蛋白表达水平,卡方检验分析PIM-1和Eg5蛋白表达阳性率与前列腺癌的临床病理特征之间的关系,采用Spearman相关分析PIM-1与Eg5蛋白在前列腺癌中的相关性。结果:PIM-1和Eg5蛋白在前列腺癌中表达增高,明显高于前列腺增生,差异有统计学意义(P<0.05),PIM-1和Eg5蛋白表达阳性率与Gleason评分、临床分期、术前PSA和5年生化复发有关(P<0.05);与患者年龄无关(P>0.05)。PIM-1和Eg5蛋白表达阳性率高的生化复发率高于PIM-1和Eg5蛋白表达阳性率低的患者(P<0.05),相关性分析显示,前列腺癌中PIM-1和Eg5蛋白呈正相关(r=0.825,P<0.05)。结论:PIM-1和Eg5基因可能与前列腺癌演化和进展有关,二者联合检测有望提高对前列腺癌的预测能力。

东方蜜蜂微孢子虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的生物信息学分析

旨在解析东方蜜蜂微孢子虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase)基因STPK的理化性质和分子特性,并对东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫的STPK进行结构域和保守基序预测及系统进化分析,以期丰富东方蜜蜂微孢子虫的STPK信息,并为深入开展STPK的功能研究提供基础。通过Expasy网站上的相关软件预测和分析STPK的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种STPK的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的STPK进行氨基酸序列多重比对,并采用邻接法构建基于STPK的系统进化树。结果显示:东方蜜蜂微孢子虫STPK基因含2 595个核苷酸,编码的STPK蛋白含864氨基酸。分子量约为101.08 kDa,分子式为C_(4528)H_(7150)N_(1162)O_(1379)S_(36),脂溶系数为88.48,等电点为5.47;STPK包含40个丝氨酸磷酸化位点,24个酪氨酸磷酸化位点及23个苏氨酸磷酸化位点。东方蜜蜂微孢子虫与其他9个微孢子虫及柑橘凤蝶(Papilioxuthus)的STPK均含有2个相同的结构域(PK_Tyr_Ser_Thr和Pkinase)与5个相同的保守基序(Motif 1, Motif 2, Motif 3, Motif 4和Motif 5)。东方蜜蜂微孢子虫与其他9个微孢子虫的STPK序列一致性介于38.14%~61.06%,东方蜜蜂微孢子虫和蜜蜂微粒子虫的STPK序列一致性最高(61.06%)。东方蜜蜂微孢子虫STPK(AAJ76_500008712)与颗粒病微粒子虫(Nosemagranulosis)STPK(KAF9763807.1)聚为一支,微孢子虫属(KAH9412228.1)、脑炎微孢子虫(KAG5858968.1)和兔脑炎微孢子虫(ECU01_1320)的STPK聚为一支,康氏泰罗汉孢虫(KAF7683612.1)和蝗虫微孢子虫(AAT12343.1)聚为一支。研究结果明确了STPK的理化性质和分子特性,揭示东方蜜蜂微孢子虫和上述其他9种微孢子虫的STPK具有较高的保守性。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1基因沉默对肺癌细胞生物学行为的影响

目的研究丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(LKB1)基因表达沉默对肺癌细胞生物学行为的影响。方法以RNA干扰技术建立LKB1表达抑制的细胞模型,Western blotting方法检测干扰LKB1蛋白表达的效果;通过绘制生长曲线和克隆形成试验检测LKB1基因沉默肺癌细胞的增殖变化;应用Annexin V/PI双染法和流式细胞技术分析LKB1基因沉默后肺癌细胞周期的变化及其凋亡和坏死情况。结果成功建立了LKB1基因沉默肺癌细胞模型,稳定表达LKB1-siRNA细胞的LKB1蛋白表达被明显抑制,LKB1基因沉默后肺癌细胞增殖速度明显加快,但其早期与晚期凋亡率较对照组相比并无显著变化。结论LKB1基因的下调表达对95D细胞部分恶性生物学行为的发生具有一定的促进作用。

表皮生长因子受体/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶通路对小鼠黑素瘤B16细胞迁移的影响

目的:研究表皮生长因子受体(EGFR)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)通路对小鼠黑素瘤B16细胞迁移的影响。方法:蛋白质免疫印迹方法分析各蛋白的表达;phagokinetic track motility法观察细胞的迁移。结果:表皮生长因子(EGF)能促进小鼠黑素瘤B16细胞迁移;AKT抑制剂(wortmannin)和水通道蛋白-3(aquaporins-3,AQP3)抑制剂(CuSO_4)能抑制小鼠黑素瘤B16细胞迁移;EGF可诱导AKT磷酸化,EGF处理后5 min磷酸化AKT达到高峰。wortmannin和CuSO_4可抑制细胞中AQP3的表达。结论:在小鼠黑素瘤B16细胞中,EGF通过磷酸化EGFR,激活AKT,进而使AQP3表达上调,促进B16细胞迁移。这一通路可被AKT和AQP3抑制剂阻断,这些涉及的信号通路可能成为潜在的治疗黑素瘤的靶点。

针刺激活轴抑制蛋白1、腺苷酸活化蛋白激酶、丝/苏氨酸蛋白激酶信号通路对失神经骨骼肌萎缩大鼠的保护作用

目的研究针刺对失神经骨骼肌萎缩大鼠骨骼肌细胞丝/苏氨酸蛋白激酶(AKT)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、轴抑制蛋白1(Axin1)表达水平的影响。方法将48只SD大鼠采用简单随机分组分为空白对照组、假手术组、模型组和针刺组各12只。模型组和针刺组大鼠采用手术切断坐骨神经制备失神经骨骼肌萎缩大鼠模型,假手术组只暴露坐骨神经,空白对照组不做任何处理。针刺组在造模后进行电针治疗(“足三里”和“承山”穴),每次10 min,连续治疗3周。治疗后,检测各组大鼠绯肠肌组织的湿重比、肌纤维横截面积及肌细胞直径比;HE染色检测各组大鼠绯肠肌损伤;TUNEL染色检测各组大鼠绯肠肌细胞凋亡;蛋白质印迹法(Westernblotting)检测p-AKT、AKT、p-AMPK、AMPK、Axin1、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl相关X蛋白(Bax)、活化胱天蛋白酶(cleavedcaspase-3)和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达。结果与空白对照组和假手术组相比,模型组大鼠腓肠肌湿重比(0.38±0.06)、肌纤维截面积比(0.52±0.12)和肌纤维直径比(0.53±0.16)均明显下降(P<0.05),细胞凋亡率(30.85±5.74)%明显升高(P<0.05),Bcl-2(0.40±0.03)、Bax(0.53±0.05)、cleavedcaspase-3(0.58±0.06)、PCNA(0.44±0.05)、p-AKT/AKT(0.54±0.06)、p-AMPK/AMPK(0.73±0.04)和Axin1(0.41±0.05)的表达明显上调(P<0.05);与模型组相比,针刺组大鼠腓肠肌湿重比(0.52±0.07)、肌纤维截面积比(0.64±0.11)和肌纤维直径比(0.66±0.15)均明显增加(P<0.05),细胞凋亡率(21.39±3.87)%明显下降(P<0.05),Bcl-2(0.61±0.05)、PCNA(0.72±0.08)、p-AKT/AKT(0.82±0.09)和Axin1(0.62±0.06)的表达明显上调(P<0.05),Bax(0.33±0.04)、cleavedcaspase-3(0.34±0.04)和p-AMPK/AMPK(0.51±0.03)的表达明显下调(P<0.05)。结论针刺可能通过调控Axin1/AMPK/AKT的表达,延缓失神经大鼠骨骼肌的萎缩。

家族性进行性色素过度沉着症家系丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11基因的克隆和序列鉴定

目的进行家族性进行性色素过度沉着症(FPH)家系中患者丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11(STK11)基因的克隆和序列鉴定,以期检测FPH发生是否由于STK11突变所致。方法从FPH患者永生化的B淋巴细胞中提取总RNA,反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获取cDNA序列,加入特异性引物经PCR扩增STK11 cDNA双链,再经过HindⅢ、EcoRI双酶切PCR产物及质粒载体pcDNA3.0,酶切产物经回收、连接,产物转化到大肠杆菌DH5α,选取阳性克隆菌落进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析。结果成功构建重组质粒pcDNA3.0-STK11,其测序结果与美国国立生物技术信息中心查询的正常序列结果一致。结论该FPH家系发病并非由于STK11突变所致,在初步定位FPH致病基因的19p13.1-pter区段存在尚未发现的致病基因。

猪瘟病毒衣壳蛋白与宿主丝/苏氨酸蛋白激酶N1相互作用的鉴定

为筛选并鉴定与猪瘟病毒(CSFV)衣壳(C)蛋白相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交技术以CSFV C蛋白为诱饵从猪外周血单个核细胞(PBMC)c DNA表达文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白,共筛选到6种蛋白,分别为ATP5B、SON3、PKN1、PCBP1、RPS20和IQGAP1,根据Gene Ontology分析结果,这些蛋白分别参与细胞的增殖和代谢等过程。本研究选取丝/苏氨酸蛋白激酶N1(PKN1)进行进一步验证,经酵母共转化试验、免疫共沉淀试验和GST pull-down试验证实,宿主PKN1蛋白与CSFV C蛋白之间存在特异性结合。本研究首次证明PKN1与CSFV蛋白之间的相互作用关系,为进一步研究PKN1蛋白在CSFV感染过程中发挥的作用奠定了基础。

柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶真核表达质粒的构建及其在DF-1细胞中的表达

为了构建柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Eimeria tenella serine/threonine protein kinase,Et STK)基因的真核表达重组质粒,并实现在DF-1细胞中的表达,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增Et STK基因,将扩展产物与真核表达质粒pc DNA3.1-flag连接,构建重组真核表达质粒pc DNA3.1-flag-Et STK,测序鉴定正确后,转染DF-1细胞进行表达,利用Western blot和间接免疫荧光(indirect immunofl uorescene assay,IFA)对其表达情况进行鉴定。结果表明重组质粒pc DNA3.1-flag-Et STK构建成功。Western blot显示在54 k Da处出现条带;IFA检测到特异性的绿色荧光,表明构建的重组质粒pc DNA3.1-fl ag-Et STK成功地在DF-1中实现了表达。本研究结果为深入了解柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的功能及球虫核酸疫苗提供了基础。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活的长链非编码RNA对甲状腺癌细胞凋亡和自噬行为的影响

目的:探讨丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase B-Raf,BRAF)激活的长链非编码RNA(BRAF-activated long-chain non-coding RNA,lnc RNA-BANCR)对甲状腺癌细胞凋亡和自噬行为的影响及其机制。方法:RT-PCR检测lnc RNA-BANCR在甲状腺癌组织和癌旁正常甲状腺组织中的表达情况;分析lnc RNA-BANCR和甲状腺癌患者的临床病理资料之间的关联;采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测lnc RNA-BANCR对甲状腺癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测lnc RNA-BANCR对甲状腺癌细胞凋亡行为的影响;Transwell侵袭实验检测lnc RNA-BANCR对甲状腺癌细胞侵袭能力的影响,Wsetern印迹检测抑制lnc RNA-BANCR的表达后自噬蛋白LC3-I和LC3-II表达的变化情况。结果:与正常甲状腺组织相比,甲状腺癌组织中lnc RNA-BANCR表达水平较高(P<0.05);lnc RNABANCR的表达与甲状腺癌的病理分期和淋巴结转移情况有关,分期越高,lnc RNA-BANCR在甲状腺癌组织中表达越高(P<0.05);抑制lnc RNA-BANCR的表达后,在一定程度上可抑制甲状腺癌细胞的增殖和侵袭能力(均P<0.05);同时可使甲状腺癌细胞的凋亡行为得到一定的促进(P<0.05);自噬蛋白LC3-I和LC3-II的表达水平相应增高(均P<0.05)。结论:lnc RNA-BANCR的表达通过影响甲状腺癌细胞的自噬行为而对其增殖、侵袭及凋亡行为产生影响。

磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶信号途径及其在肌肉生长发育中的调控机制

磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)是一类特异性催化磷脂酰肌醇(PI)的激酶,其信号途径是细胞内重要的信号转导通路之一,广泛参与动物机体的新陈代谢过程。本文就PI3K/Akt信号途径的结构、活化机制及其在细胞凋亡和肌肉生长发育中的调控机制进行综述。

富含脯氨酸的酪氨酸激酶2和磷酸化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在舌鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义

目的探讨富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)和磷酸化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)在舌鳞状细胞癌(TSCC)及其癌旁非肿瘤组织中的表达差异及临床意义。方法采用免疫组织化学法检测45例TSCC组织及30例癌旁非肿瘤组织中Pyk2和p-AKT蛋白的表达情况,并分析两者蛋白表达与临床病理参数的关系。结果在TSCC组织中Pyk2和p-AKT蛋白均呈高表达,而在癌旁非肿瘤中呈低表达或无表达(P<0.05)。并且两者的表达呈正相关(γs=0.412)。Pyk2蛋白的表达与病理分化程度、有无淋巴结转移及TNM临床分期有关(P<0.05),与性别、年龄无关。而p-AKT只与病理分化程度有关(P<0.05)。结论 Pyk2和p-AKT蛋白异常表达与TSCC的发生、发展密切相关,联合检测两者有望成为明确TSCC恶性程度的指标。

替米沙坦通过磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶途径改善内皮祖细胞的功能活性

目的研究替米沙坦对内皮祖细胞增殖、迁移、黏附等生物学活性的影响并探讨其可能机制。方法利用密度梯度离心法分离、培养人外周血单个核细胞,经FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色鉴定为正在分化的内皮祖细胞。将分离、培养的内皮祖细胞分为对照组、替米沙坦组(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)、过氧化体增殖物激活型受体γ抑制剂(GW9662)干预组和磷脂酰肌醇-3-羟基激酶抑制剂(Ly294002)干预组。采用MTT比色法、Transwell小室、细胞计数法观察各组内皮祖细胞增殖、迁移、黏附能力的变化情况。同时采用免疫蛋白印迹法观察替米沙坦处理内皮祖细胞后丝苏氨酸蛋白激酶及磷酸化丝苏氨酸蛋白激酶的表达情况。结果与对照组相比,替米沙坦组内皮祖细胞增殖、迁移、黏附能力显著提高,且在不同浓度组间呈剂量依赖性增强,而在过氧化体增殖物激活型受体γ抑制剂干预组和磷脂酰肌醇-3-羟基激酶抑制剂干预组,内皮祖细胞功能活性的改善受到明显的抑制。免疫蛋白印迹检测显示,相比于对照组,替米沙坦组磷酸化丝苏氨酸蛋白激酶的表达水平明显增高,而在过氧化体增殖物激活型受体γ抑制剂干预组磷酸化丝苏氨酸蛋白激酶的表达相比于对照组未见明显增高。结论替米沙坦具有促进内皮祖细胞增殖、迁移、黏附等功能的作用,其主要机制可能与过氧化体增殖物激活型受体γ介导的磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶信号通路激活有关。

猪精氨酸-丝氨酸蛋白激酶1(SRPK1)克隆表达及功能初步分析

本研究旨在阐明猪SRPK1基因的分子特点和表达谱。以大白猪为研究对象,利用RT-PCR技术克隆SRPK1基因CDS区域,同时利用反向PCR(inverse PCR,I-PCR)技术得到猪部分SRPK1的5′UTR序列;利用生物信息学方法分析SRPK1基因核苷酸序列及编码蛋白序列的结构特点;利用荧光定量PCR(real-time PCR)检测SRPK1在1和30日龄大白猪及杜洛克的心脏、肌肉、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、小肠、大肠、脑的表达情况;构建猪骨骼肌损伤模型,研究在骨骼肌发育过程中SRPK1基因的表达特性。结果,将克隆片段拼接得到长2499bp的大白猪SRPK1基因序列,包含了1968bp完整CDS区域,分析表明其编码含656个氨基酸的蛋白质;包括2个P_Kc结构域,猪SRPK1蛋白序列与人和黑猩猩的相似性较高。通过生物信息学方法预测所得5′UTR含有多个转录结合位点:HSF1、HSF2、Ik-1、IK-2、SRY、SP1MyoD、USF、E47、p300、CP2、RREB-1、E2F和AP-1。利用荧光定量PCR研究发现,表达结果显示猪该基因表达具有组织和种间特异性,主要都是在胃、大肠和小肠中表达。SR-PK1基因在整个损伤修复过程中的表达反复出现升高和降低。5′UTR处有多个和肌肉生长相关蛋白的转录结合位点,主要在消化系统组织表达,在骨骼肌修复中表达上调,推测其可能与骨骼肌细胞发育或其他肌肉生长相关因子的表达有关。