甲醇利用菌MB200丝氨酸乙醛酸氨基转移酶基因(sga)的克隆、突变及对产L-丝氨酸的影响

sga基因是大多数Methylobacteriumsp.中丝氨酸循环途径里的一个关键酶基因,与单碳化合物的同化及二碳化合物的代谢有着密切的关系。根据已报道的M.extorquensAM1的sga基因序列,合成寡核苷酸引物,用本实验室保存的甲醇利用菌M.sp.MB200的染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增出sga基因,测序分析表明该基因与M.extorquensAM1的sga基因在核苷酸水平上有93%的同源性,氨基酸水平上具有85%的同源性。利用自杀质粒pK18mob构建含有sga基因部分片段的重组质粒,通过三亲本结合后导入原始菌株MB200中,经过进一步同源单交换,sga基因被pK18mob插入突变,利用PCR和Southern杂交进行验证,选择发生正向突变的突变株MB200sTB用于进一步研究分析。分析结果表明突变菌株的丝氨酸乙醛酸氨基转移酶(SGAT)的酶活性消失,同时失去了在以甲醇为唯一碳源的培养基上生长的能力,不能再合成L-丝氨酸,但仍能以二碳化合物和多碳化合物进行生长。

沉默赖氨酸乙酰基转移酶基因对人甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨赖氨酸乙酰基转移酶(Kat5)对甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)信号通路的作用,阐明Kat5在甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡中的可能作用机制。方法:RT-PCR和Western blotting法检测甲状腺乳头状癌BHP10-3、TPC-1、K1细胞和甲状腺上皮Nthy-ori3-1细胞中Kat5 mRNA和蛋白表达水平。将对数生长期甲状腺乳头状癌TPC-1细胞分为空白对照组、阴性对照组和沉默Kat5组(si-Kat5组)。空白对照组甲状腺乳头状癌TPC-1细胞不转染,阴性对照组甲状腺乳头状癌TPC-1细胞转染阴性对照siRNA,si-Kat5组甲状腺乳头状癌TPC-1细胞转染Kat5 siRNA。RT-PCR和Western blotting法检测各组甲状腺乳头状癌TPC-1细胞中Kat5 mRNA和蛋白表达水平,CCK-8法检测各组TPC-1细胞增殖活性,克隆形成实验检测各组TPC-1细胞克隆形成率,流式细胞术检测各组TPC-1细胞凋亡率,Western blotting法检测各组TPC-1细胞中周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、P21、P53、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、AKT和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白水平。结果:甲状腺乳头状癌BHP10-3、TPC-1和K1细胞中Kat5 mRNA和蛋白表达水平均高于甲状腺上皮Nthy-ori3-1细胞(P<0.05)。各组TPC-1细胞中Kat5 mRNA和蛋白水平、细胞增殖活性、细胞克隆形成率、细胞凋亡率以及细胞中CDK2、P21、P53、cleaved caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.05);与空白对照组和阴性对照组比较,si-Kat5组TPC-1细胞中Kat5 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05),细胞增殖活性降低(P<0.05),细胞克隆形成率降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中CDK2、p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平降低(P<0.05),P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:甲状腺乳头状癌细胞中Kat5 mRNA和蛋白表达水平升高,沉默Kat5基因可抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与其抑制PI3K/AKT信号通路有关。

人脂肪组织来源的酪氨酸羟化酶、胆碱乙酰转移酶、谷氨酸脱羧酶的表达

目的:探讨人脂肪组织来源的基质细胞(ADSCs)分化为神经细胞的神经递质关键酶TH、CHAT、GAD的表达情况。方法:分离培养人ADSCs,采用神经诱导培养基(NIM)进行诱导培养,倒置相差显微镜下连续观察细胞生长情况和形态变化,免疫组化法和免疫荧光技术检测神经递质多巴胺(DA)、乙酰胆碱(Ach)和!-氨基丁酸(GABA)合成过程中的关键酶——酪氨酸羟化酶(TH)、胆碱乙酰转移酶(CHAT)和谷氨酸脱羧酶(GAD)的表达情况。结果:①经NIM诱导后,ADSCs可分化为神经细胞。诱导分化后,1h、5h未见TH、CHAT和GAD阳性表达。1d、5d出现TH、CHAT和GAD阳性表达。②免疫荧光单标结果:诱导后的细胞内有TH、CHAT和GAD表达。免疫荧光双标结果:GAD与TH、CHAT与TH可同时表达于同一个诱导后的细胞内。结论:ADSCs可分化为神经细胞,分化后的神经细胞具有合成神经递质DA、Ach和GABA的功能。

丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA)的克隆

采用PCR方法从大肠杆菌K12染色体DNA中克隆出1.5kb的DNA片段,并将其与pUCm-T载体连接转入大肠杆菌JM109中。DNA测序分析证明该片段含有一个完整的丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA)。

N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸调节α-微管蛋白乙酰转移酶1抑制矽肺纤维化

目的探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)能否通过对α-微管蛋白乙酰转移酶1(α-TAT1)调节而发挥抗矽肺纤维化作用。方法Wistar大鼠随机分为3组:对照组、矽肺模型组、Ac-SDKP处理组,每组6只。原代培养大鼠的肺成纤维细胞分为5组:对照组、转化生长因子(TGF-β1)诱导组、Ac-SDKP预处理组(TGF-β1+Ac-SDKP)、α-TAT1沉默组(α-TAT1-siRNA+TGF-β1+Ac-SDKP)、α-TAT1过表达组(α-TAT1-cpDNA+TGF-β1+Ac-SDKP)。免疫组化检测大鼠肺组织中α-TAT1的表达与分布,Western blot检测大鼠肺组织及大鼠肺成纤维细胞中I型胶原(Col I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、乙酰化微管蛋白-α(Ac-Tubα)、α-TAT1蛋白的表达水平。结果矽肺模型组大鼠的肺组织中出现矽结节,α-TAT1在矽结节中表达缺失,Western blot结果显示,矽肺模型组和TGF-β1诱导的肺成纤维细胞中Col I和α-SMA蛋白表达上调,Ac-Tubα和α-TAT1蛋白表达下调。Ac-SDKP治疗可抑制该变化。Ac-SDKP对Col I、α-SMA表达抑制效应可被α-TAT1-siRNA阻断,而α-TAT1过表达可加强Ac-SDKP对Col I、α-SMA表达的抑制作用。结论Ac-SDKP通过调节α-TAT1的表达抑制肌成纤维细胞分化,发挥抑制矽肺大鼠肺纤维化的作用。

磷脂酰丝氨酸合成酶基因pss的克隆与表达

磷脂酰丝氨酸合成酶能催化转酯反应,是定向合成特定磷脂类物质特别是磷脂酰丝氨酸的工具酶,但出发菌株产量低,很大程度上限制了酶法合成磷脂酰丝氨酸的工业化应用。利用表达载体pET-22b,实现了大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的同源高效表达。利用镍亲和柱对表达产物进行纯化,并用HPLC法对纯化后的重组酶的活力进行检测。结果表明,目的蛋白可在短时间内进行大量表达,蛋白含量是出发菌株的100倍,同时经6h的转酯反应转化率达到33%,重组磷脂酰丝氨酸合成酶活力达到69U/mg蛋白。

植物丝氨酸羟甲基转移酶基因研究进展

丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)是一个含有磷酸吡哆醛(PLP)的四聚体的蛋白质,在亚甲基四氢叶酸(CH2-THF)存在时催化丝氨酸和四氢叶酸生成甘氨酸和N5,N10-亚甲基四氢叶酸的可逆反应。SHMT在高等植物的一碳代谢和光呼吸中起着非常重要的作用,最近随着植物SHMT纯化技术的进步和重要模式植物基因组测序的完工,使很多植物SHMT基因被克隆出来,并对它们的结构和功能及表达调控进行研究。

水稻丝氨酸棕榈酰转移酶的分子克隆、特征及其与褐飞虱抗性相关的基因表达（英文）

为研究鞘脂质和鞘脂质代谢前体长链基团(long-chain bases,LCBs)对胁迫应答的调控机制,对编码水稻丝氨酸棕榈酰转移酶(serine palmitoyltransferase,SPT)的LCB基因进行克隆。通过反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增到3条LCB1和3条LCB2基因全长,蛋白质大小为481～497个氨基酸。生物信息学分析表明,LCB蛋白序列在细菌到人等多个物种中具有高度保守性。在褐飞虱(brown planthopper,BPH)的侵害作用下,水稻Os LCB2a1基因表达量上升。与其他水稻品种相比,抗性品种"Mudgo"和"IR64"中的基因表达量更高。基因表达量与褐飞虱危害指数呈负相关。在不同水稻品种的不同组织中,"IR64"叶片中的基因表达量显著升高,而"态平籼"叶鞘中的基因表达量显著升高。Os LCB2a1基因在抗褐飞虱水稻品种的最高分蘖期呈高表达,表明该基因可能在水稻营养期发挥作用。

FAM135B与赖氨酸乙酰转移酶在维吾尔族食管鳞状细胞癌中的表达

目的探讨序列相似家族135成员B(FAM135B)与赖氨酸乙酰转移酶(KAT5)在维吾尔族食管鳞状细胞癌(ESCC)中的表达规律。方法使用罗氏全自动免疫组化仪检测40对维吾尔族ESCC及其癌旁组织中FAM135B与KAT5的表达情况,分析两种蛋白间表达的相关性及与临床特征的相关性。结果维吾尔族ESCC标本中FAM135B、KAT5表达分别占92.50%(37/40)、15.00%(6/40);癌组织中FAM135B表达强阳性者所占比例高于癌旁组织[45.00%(18/40)vs 22.50%(9/40),χ~2=4.528,P=0.033];癌组织中KAT5表达阴性者所占比例与癌旁组织差异无统计学意义[85.00%(34/40)vs 87.50%(35/40),χ~2=0.105,P=0.745];ESCC与其配对癌旁组织FAM135B强阳性表达具有良好正相关性(Kendall相关系数=0.707,P<0.001);癌组织的FAM135B强阳性表达与其KAT5表达具有显著负相关性(Kendall相关系数=-0.946,P<0.001);FAM135B与KAT5表达与ESCC患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床分期均无明显相关性(P>0.05)。结论 FAM135B强阳性表达可能是维吾尔族ESCC发生的重要分子基础,且该分子可能通过KAT5的负性表达发挥作用。

水稻线粒体丝氨酸羟甲基转移酶基因的电子克隆

采用基于EST的电子克隆方法得到了一段长 16 11bp的cDNA序列 ,以此为信息探针搜索HTGs数据库 ,找到一个与之高度匹配的基因组DNA序列———OSJNBa0 0 5 7G0 7克隆。用FGENESH分析该克隆中的联配区域得到一个包含 14个外显子和 13个内含子的基因。该基因位于水稻第 3染色体物理图谱的 136 .0～ 137.6cM区域。推导的ORF编码 4 98个氨基酸 ,经BLASTP搜索SWISS -PROT数据库和蛋白序列的亚细胞定位显示 ,该基因编码水稻的线粒体丝氨酸羟甲基转移酶 (mSHMT)。该基因受到EST序列的完全支持 ,其中不乏来自盐胁迫、稻瘟病菌侵染等逆境处理的EST序列 ,推测该基因与水稻对逆境的应答反应有关。

大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA)的克隆和表达

利用插入失活及营养缺陷型互补法将大肠杆菌K12 13kb的glyA基因克隆到质粒pBR329中。将重组质粒酶切,亚克隆,确定2.6kb PstI-EcoRI亚克隆片段带有完整的glyA基因。共获得12株glyA基因重组菌,对重组质粒进行了酶切鉴定。不同重组菌丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)活性及其酶表达量均不相同。受体菌未检测到丝氨酸的产生。重组菌株JM109(pSM13)、K12(pSM13)、K12(pSM14)和K12(pSM15)SHMT酶表达量分别占全菌可溶性蛋白的15.7％、15.4％、11.8％和9.48％。

丝氨酸羟甲基转移酶基因的功能表达及其活性鉴定

从大肠杆菌染色体DNA中成功克隆到丝氨酸羟甲基转移酶基因 ,并将其插入表达载体 pET15b中 ,在大肠杆菌中得到了高表达。

glyA基因及其编码的丝氨酸羟甲基转移酶

glyA基因广泛存在于生物体中 ,其编码的丝氨酸羟甲基转移酶 (serinehydroxymethyltransferase,SHMT)催化丝氨酸和甘氨酸之间的相互转化 ,转化反应产生的 5,1 0 亚甲基四氢叶酸 (M THF)提供细胞新陈代谢—碳单位 ,此反应在细胞新陈代谢中处于重要地位。因此 ,研究 glyA基因及其编码的丝氨酸羟甲基转移酶具有重要的意义。介绍了 glyA基因的克隆、序列分析、调控组分和丝氨酸羟甲基转移酶的部分性质。

角叉菜丝氨酸乙酰转移酶的分子克隆及生物学特性分析

丝氨酸乙酰转移酶(SAT,EC 2.3.1.30)是硫同化中非常重要的一个酶,是半胱氨酸合成的关键酶,催化丝氨酸转化为氧乙酰丝氨酸的反应,后者再生成半胱氨酸。本研究从红藻门杉藻科角叉菜(Chondrus crispus)c DNA文库中克隆了角叉菜丝氨酸乙酰转移酶基因(cys E)全长序列(Gen Bank序列号KT963952)。序列分析表明,其ORF区长1143 bp,编码由380个氨基酸组成的蛋白,理论分子量为40.60 k Da,理论等电点为6.26。生物信息学分析表明角叉菜SAT与其他物种的SAT的氨基酸序列具有较高的同源性。本研究为探讨SAT在角叉菜硫代谢中的作用提供了实验基础。

精神分裂症患者磷酸丝氨酸氨基转移酶1基因多态性与利培酮疗效关联性研究

目的观察精神分裂症患者磷酸丝氨酸氨基转移酶1基因多态性与利培酮疗效的相关性。方法精神分裂症患者158例,按隔日加量法则,利培酮逐渐加至治疗剂量(2～6 mg.d-1),根据不良反应情况调整剂量,平均治疗量(3.82±0.95)mg.d-1。出现药物不良反应时采取对症治疗、减量或换药治疗。观察6周,在第0,6周评定阳性与阴性量表评分(PANSS)。采用聚合酶链反应扩增及单核苷酸多态性的分子生物学技术测定磷酸丝氨酸氨基转移酶1基因的rs69287125、rs137824326多态性分型,比较不同分型患者的利培酮疗效。结果 rs69287125和rs137824326位点基因型和等位基因频数在男女患者中差异无统计学意义(P>0.05);治疗6周后,rs69287125位点PANSS总分、阳性因子分、阴性因子分在三个不同基因型中差异有统计学意义(P<0.05),A/A基因型分值最高;rs137824326位点PANSS总分、阳性因子分、阴性因子分、一般精神病理分在3个不同基因型中差异有统计学意义(P<0.05),A/A基因型分值最高。结论精神分裂症患者磷酸丝氨酸氨基转移酶1基因多态性与利培酮疗效存在关联。

重氮乙酰丝氨酸诱导大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变及其K-ras基因突变的实验研究

建立大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变的动物模型，了解该癌前病变及Ｋｒａｓ 基因突变的情况 雄性Ｗｉｓｔａｒ 大鼠单次腹腔注射重氮乙酰丝氨酸３０ｍｇ／Ｋｇ 体重，４ 个月后常规取胰腺组织行光镜和电镜检查，并应用ＰＣＲＳＳＣＰ法检测Ｋｒａｓ 基因突变情况 大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变发生率１００％ ，Ｋｒａｓ 基因突变率４２－１ ％ 。重氮乙酰丝氨酸可成功诱导大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变，Ｋｒａｓ 基因突变在此过程中属早期事件。

N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因的克隆与表达

目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌。方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21(DE3),然后将nanA基因片段组入到pDR540载体的Ptac启动子下游,所得重组菌E.coliDH5α/pRY3的nanA基因在tac启动子控制下呈组成型表达。结果:DNA序列测定证明,该基因的开放阅读框(open read ing frame,ORF)大小为894 bp,编码298个氨基酸组成的酶蛋白;SDS-PAGE显示,纯化的目的蛋白为33 kD的单一条带。以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21(DE3),在得到的转化子E.coliBL21(DE3)/pRY1中,nanA基因受lac启动子控制,无需IPTG或乳糖所诱导。在N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶的催化下合成N-乙酰-D-神经氨酸的合成效率为78.3%,结晶回收率为90.2%,总回收率为70.6%。全波长扫描分析表明:本实验室结晶品与Sigma公司商品的全波长扫描图谱有相同的特征。结论:所构建的诱导型产酶菌株E.coliBL21(DE3)/pRY1和组成型表达菌株E.coliDH5α/pRY3都可较多量的产酶。合成的结晶品具有N-乙酰-D-神经氨酸的特征。

坛紫菜丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及表达特征

丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)在植物应答逆境胁迫中发挥着重要作用。本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)为研究材料,采用普通PCR技术克隆得到2条坛紫菜的SHMT全长基因序列,分别命名为PhSHMT-1(GenBank收录号:MF687405)和PhSHMT-2(GenBank收录号:MF687406)。其中,PhSHMT-1序列全长1710 bp,包含一个1491 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含497个氨基酸,分子量为121.443 kDa,等电点为4.93;PhSHMT-2序列全长1957 bp,包含一个1395 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含465个氨基酸,分子量为113.969 k Da,等电点为4.95。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhSHMT-1和PhSHMT-2基因属于SHMT基因家族。qRT-PCR定量分析结果表明,高温胁迫条件下,2条PhSHMT基因的表达模式基本一致,均表现为先上调后下调再上调的趋势,这说明SHMT基因可能在坛紫菜应答高温胁迫过程中发挥作用。

一株高产丝氨酸羟甲基转移酶基因工程菌的构建及发酵产酶条件优化

以E.coli AB90054基因组中DNA为模板,采用PCR方法扩增得到glyA基因,将该基因克隆到表达载体pET28a(+)中,转化表达菌株BL21(DE3)后筛选阳性重组子,并对筛选所得高表达基因工程菌G16进行培养条件和表达条件的优化。结果表明,当培养条件为38℃、pH为7.0、转速为150r/min时,基因工程菌的生长速度和菌液浓度最佳;当表达条件的诱导温度为30℃、诱导剂浓度为0.5mmol/L、诱导时间为5h时,基因工程菌诱导目的蛋白表达效果最好。通过SDS-PAGE分析和酶活测定后发现,在优化条件下基因工程菌G16发酵产丝氨酸羟甲基转移酶能力占菌体总蛋白的60%左右,且蛋白活性正常。