美找出新的丝氨酸水解酶抑制剂

美国科学家鉴别并合成出一类新化合物,能有力地、有选择地阻止很多丝氨酸水解酶的活动,因此,在基础研究和药物研发领域具有重要用途,相关研究发表在今天出版的《自然·

运用神经网络识别丝氨酸水解酶活性中心

本文运用Ｂａｃｋ－Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ神经网络模型，以空间关系和物化性质作为特征描述，对丝氨酸水解酶进行了活性中心（ＳＥＲ－ＨＩＳ－ＡＳＰ）识别，以１７个蛋白作为训练组，识别组选取了２个蛋白（１ｓ０２，１ｃｓｅ）识别结果均达唯一解。

氮硫供应对大葱含硫有机物及其代谢关键酶活性的影响

以长白型大葱品种章丘大葱和鸡腿型大葱品种隆尧鸡腿葱为试材,采用基质盆栽试验研究了不同氮、硫供应水平对大葱含硫有机物含量及其代谢关键酶活性的影响。结果表明,隆尧鸡腿葱含硫有机物含量显著高于章丘大葱。氮、硫供应显著影响植株地上部氮、硫含量与代谢关键酶活性。氮素供应水平为1.5mmol/L时抑制大葱地上部ATP硫酸化酶(ATPS)和O-乙酰丝氨酸水解酶(OASS)活性,而氮素供应水平为12.0 mmol/L时明显促进上述两种酶的活性,但氮素供应水平上升到24.0 mmol/L时则抑制了其活性。提高供硫水平则显著抑制ATPS酶和OASS酶的活性。植株含氮量与有机硫含量均与ATPS和OASS活性显著相关。

犬小孢子菌FSH1基因干扰载体的构建及验证

目的为了构建犬小孢子菌FSH1基因的RNA干扰重组质粒,并验证其干扰效率。方法以犬小孢子菌FSH1基因全长cDNA为模板,利用PCR技术扩增FSH1基因,将质粒pUC-PUT进行双酶切使其线性化,插入FSH1正向及反向干扰序列,获得中间载体pUC-PFUFT,将其及质粒pCB-309双酶切后连接,构建干扰载体pCB309-PFULFT。将其转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105,获得犬小孢子菌FSH1基因RNA干扰的转化体系。用实时定量PCR方法对犬小孢子菌FSH1基因干扰前后表达量进行鉴定。结果成功构建了FSH1基因的干扰载体pCB309-PFULFT,获得FSH1基因的干扰转化子;犬小孢子菌野生株干扰后FSH1基因mRNA相对表达量较干扰前下降约70%,标准株下降约60%。结论本试验成功构建了犬小孢子菌FSH1基因的干扰载体,为后续研究FSH1基因的功能及在头癣中的发病机制奠定了基础。

牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定

用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.

丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用

目的应用荧光共振能量转移(FRET)法检测丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白水解酶(NS3-4A)活性,建立HCV蛋白酶抑制剂筛选模型。方法将质粒pMAL-c2/NS3-4A转化到大肠杆菌K12TB1中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析柱纯化得到麦芽糖结合的NS3-4A融合蛋白,用FRET法测定蛋白水解酶活性,建立特异性蛋白酶抑制剂筛选模型,优化反应体系,评价模型的可靠性。结果建立了HCV蛋白酶抑制剂高通量筛选模型,经优化确定了酶及底物用量。在模型可靠性评价中,Z因子高达0.80,变异系数为1.91%。蛋白酶的Km值为4.74μmol/L,测得已知HCV蛋白酶抑制剂BILN 2061的Ki值为0.30 nmol/L。结论建立的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂FRET法筛选模型稳定可靠,适用于高通量筛选。

Ca^(2+)激活猪凝血酶原作用的初步研究

为探讨Ca2 + 激活猪凝血酶原的最适工作浓度和激活时间 ,以新鲜猪血为材料 ,采用HAc等电点沉淀法获取凝血酶原后 ,添加 0 .2 5mol/LCaCl2 作为凝血酶原激活剂 ,使Ca2 + 达到不同终浓度 ,并经过不同激活时间进行对比试验。结果显示以Ca2 + 单一因子激活猪凝血酶原的最适CaCl2终浓度为 0 .0 5mol/L ;最适激活时间为 1.5h。使Ca2 + 激活猪凝血酶原的实验条件得以确立。

纤维蛋白溶解系统与缺血性脑血管病

纤维蛋白溶解系统在缺血性脑血管病的发生和发展中起着重要作用。组织型纤溶酶原激活物(tPA)活性降低、tPA抑制物活性增高是缺血性脑血管病的主要危险因素之一。长期以来,调节纤维蛋白溶解系统的功能是临床治疗缺血性脑血管病的手段之一,tPA也被直接用于缺血性脑血管病的治疗。但近年来的研究表明,tPA能够促进缺血或再灌注后兴奋性毒性诱导的神经元死亡,增大梗死面积。tPA的天然抑制物神经系统丝氨酸蛋白水解酶抑制物neuroserpin却能使脑梗死体积缩小,减少神经元脱失。

发色底物法测定血浆激肽释放酶原及其临床应用

1986年以来,国内开始应用人工合成的发色性多肽底物(Chromogenic Peptide Substrate,CPS)测定丝氨酸蛋白水解酶的活性,其灵敏度高、测定迅速,日益引起人们的重视。本文简要介绍发色底物法测定血浆激肽释放酶原及其临床应用。

植物羧酸酯酶的结构、表达调控及生物功能研究进展

羧酸酯酶(carboxylesterase,CXE)是一类广泛存在于动植物及微生物中具有α/β折叠水解酶活性的水解酶类。蛋白序列比对分析表明植物CXE具有一个催化活性的丝氨酸保守结构域(GXSXG基序),结合并水解各种酯类化合物。在植物中,其家族不同成员在组织中的表达存在差异,并受乙烯、病菌等因素的诱导,在除草剂活性物质激活、植物激素信号物质代谢以及生物胁迫等过程中发挥重要的生物学功能。本文对植物CXE家族成员的结构、表达调控和生物学功能进行综述,并讨论了未来可能的研究方向,为CXE功能的深入研究提供参考。

奇异变形杆菌疫苗候选抗原的鉴定及其免疫保护效果评价

目的 鉴定奇异变形杆菌疫苗候选抗原,并评价其在小鼠体内的免疫保护效果。方法 采用细菌膜蛋白提取试剂盒提取奇异变形杆菌膜蛋白,进行Western blot检测及质谱分析。化学法合成外膜蛋白F(outer membrane protein F,OmpF)及丝氨酸水解酶(serine hydrolase,SH)两种膜蛋白的编码基因,克隆至载体pET-28a,于E.coli BL21(DE3)诱导表达重组蛋白,进行Western blot检测。重组蛋白通过Ni Sepharose High Performance纯化后,经腿部肌内注射15只雌性昆明小鼠,100μg/(0.2 mL·只),共免疫3次,间隔2周。末次免疫后15 d,经眶前静脉窦采血,分离血清,间接ELISA法检测特异性抗体水平;经小鼠腹腔接种致死剂量的奇异变形杆菌,接种1个月,观察小鼠存活情况,并计算抗原的免疫保护率。结果 提取的膜蛋白可与奇异变形杆菌免疫小鼠抗血清发生特异性结合,经质谱鉴定与奇异变形杆菌APB87305(OmpF)、WP_004247605(SH)的同源性为100%。原核表达的重组蛋白OmpF及SH可与奇异变形杆菌免疫小鼠抗血清发生特异性结合,免疫小鼠后均可诱导较高水平的特异性抗体,对致死性奇异变形杆菌感染的保护率分别为100%和86.67%。结论 OmpF和SH是宿主免疫保护性抗原,有望成为制备奇异变形杆菌疫苗的新靶点。

基于结构信息的MHET降解酶挖掘及温和温度下的酶级联塑料降解

聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)的不规范使用和处置造成了严重的生态污染。酶法降解是一种环境友好的解决PET污染的方法。对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯[mono(2-hydroxyethyl)terephthalate,MHET]是PET降解过程中的具有竞争性抑制效果的中间产物,可由MHET降解酶催化水解。本研究采用生物信息学方法,结合序列和结构信息,发现了一种MHET水解酶,BurkMHETase。酶学性质研究表明该酶的最适pH和最适温度分别为7.5和40℃,在pH 7.5−10.0、30−45℃条件下相对稳定;以MHET为底物测定动力学参数kcat为(24.2±0.5)s^(-1),Km为(1.8±0.2)μmol/L,具有与目前最高效的IsMHETase相似的kcat值和更高的底物亲和力。BurkMHETase与PET降解酶IsPETase联用能够改善PET薄膜的降解效果。结构分析和突变实验表明,BurkMHETase可能已经进化出特定的结构特征来催化MHET的水解。对于MHET降解酶,在495位为芳香族氨基酸以及活性部位或远端氨基酸间的协同相互作用对于MHET水解活性似乎是必需的。因此,BurkMHETase有潜力应用于PET双酶降解系统,而所使用的生物信息学方法可以用来高效挖掘新的MHET降解酶。