金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B的表达及活性鉴定

目的:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为基础,在枯草芽孢杆菌中得到具有剪切功能的金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B。方法:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到SplB基因,同源重组到表达载体pHTSHIS上,再转化枯草芽孢杆菌;优化诱导条件发酵枯草芽孢杆菌,离心后超滤浓缩上清液,再经镍柱分离纯化;利用SDS-PAGE、Lowry法对蛋白的相对分子质量、浓度等进行分析,对蛋白的酶切活性进行鉴定。结果:金黄色葡萄球菌基因组DNA经PCR扩增得到与预计大小相符的DNA片段,通过同源重组构建了表达载体pHTS-SplB-His;选取诱导前菌液D_(600nm)为2.0、IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导4 h的最优条件发酵枯草芽孢杆菌,表达大量金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B;蛋白浓缩后,经镍柱分离纯化得到纯度较高且具有剪切功能的金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B。结论:采用枯草芽孢杆菌进行发酵表达,可提高金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B的表达量,并且能够得到具有剪切功能的蛋白。本研究可为外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的发酵技术提供重要参考。

丝氨酸类蛋白酶对GST-Cry3Aa融合表达蛋白酶解活化分析

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)产生的Cry3Aa毒素在许多鞘翅目害虫的防治中发挥了重要作用。随着昆虫抗性的产生,如何通过大肠杆菌高通量表达筛选cry3Aa基因改造突变蛋白成为了研究的重点。然而,cry3Aa基因在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达后其蛋白酶活化效果及杀虫活性均受到一定程度影响,对于影响的程度仍知之甚少。为探索cry3Aa基因所表达的融合蛋白GST-Cry3Aa中GST标签对Cry蛋白结构和功能的影响,本研究通过利用丝氨酸类蛋白酶(胰蛋白酶,糜蛋白酶)对纯化后的Cry3Aa融合蛋白进行水解条件研究分析,结果表明:在温度为11~37℃、GST-Cry3Aa与胰蛋白酶的质量比为4:1~30:1时,均可被水解出约55 k D的活性片段,而在同样条件下糜蛋白酶则无法对GST-Cry3Aa进行有效的水解活化。此外,结合I-TASSER和Swiss model对Cry3Aa与GST-Cry3Aa进行三维结构分析比对,发现GST-Cry3Aa在其结构域Ⅰ内有部分改变,推测其可能为两种丝氨酸类蛋白酶对该融合蛋白水解效果产生差异的原因。为后期构建Cry3Aa毒素高通量分子改造平台提供了理论基础。

刺参体壁胰/类胰丝氨酸蛋白酶的性质及其在自溶中的作用

以刺参体壁中丝氨酸蛋白酶为研究对象,对其部分酶学性质及其与刺参自溶的关系进行研究。采用Tris-HCl缓冲溶液提取、硫酸铵盐析、透析及超滤获得刺参体壁粗酶液。结果显示,以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物时,粗酶液的丝氨酸蛋白酶活力最高;以其为底物,测得该类蛋白酶在pH值为6.2和8.5时呈现较强酶活力峰值,两者最适温度范围均为50~55℃;Cu^2+、Fe^3+、Pb^2+、Zn^2+强烈抑制该酶的活性,Ca^2+可提高该酶活力;邻菲咯啉、乙二胺四乙酸以及半胱氨酸修饰剂均能够部分抑制该酶活力。4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、苯甲基磺酰氟、Na-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮、(3S)-7-氨基-1-氯-3-磺酰氨基-2-庚酮盐酸盐、大豆胰蛋白酶抑制剂能够显著抑制蛋白酶的活力以及自溶过程中可溶性蛋白、三氯乙酸可溶性多肽的生成。上述结果表明,刺参体壁中存在至少2种具有一定的金属离子依赖性的胰/类胰丝氨酸蛋白酶,其活性中心或底物识别位点可能有半胱氨酸的参与,该类蛋白酶很可能参与刺参自溶过程中蛋白质的降解。

杀线虫真菌——少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶的研究进展

在家畜寄生性线虫的生物控制中熏利用杀线虫真菌——少孢节丛胞菌在侵染线虫过程中分泌的胞外蛋白酶熏固定线虫并降解其体壁已显示出巨大的应用潜力。近年来,国外学者主要研究了杀线虫真菌胞外蛋白酶,特别是对少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶基因PⅡ的分离、测序分析、诱导和利用基因工程技术对该蛋白酶基因克隆和异源表达进行了研究。笔者对杀线虫真菌少胞节丛孢菌的研究进展作了阐述。

新的丝氨酸蛋白酶基因ST14(SNC19)在大肠癌中的表达研究

目的 研究新的丝氨酸蛋白酶基因 ST14(SNC19)在大肠癌中的分布和表达情况 ,探讨该基因与淋巴结转移的相关性。方法 采用原位杂交技术检测 30例大肠癌、癌旁黏膜和正常肠黏膜的 ST14表达。结果 30例病人中 ,正常肠黏膜组 ST14表达阳性率 46 .7%,癌旁黏膜组 43.3%,大肠癌组 6 .7%,前两组高于大肠癌组 (P<0 .0 5 )。淋巴结转移组癌旁黏膜 ST14表达阳性率 (6 4.7%)高于无淋巴结转移组 (15 .4%) ,差异有显著性 (P<0 .0 5 )。结论 ST14在部分大肠癌中呈表达缺陷 ,ST14可能作为预测淋巴结转移和判断预后的新指标。

肠道丝氨酸蛋白酶与腹泻型肠易激综合征

肠易激综合征(IBS)为临床常见功能性肠病,其病理生理学机制迄今尚未完全阐明。近年研究发现腹泻型IBS(IBS-D)患者肠黏膜和肠腔内丝氨酸蛋白酶的表达水平和活性明显增高,丝氨酸蛋白酶可能通过激活蛋白酶激活受体-2(PAR-2)引起肠黏膜通透性增加和内脏敏感性增高,在IBS-D的发病中起重要作用。本文就肠道丝氨酸蛋白酶与IBS-D的研究进展作一综述。

新型丝氨酸蛋白酶Matriptase在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

【目的】检测新型丝氨酸蛋白酶(Matriptase)在膀胱移行细胞癌(BTCC)中的表达,探讨与BTCC临床病理参数间的关系及其临床意义。【方法】应用免疫组化技术检测Matriptase在BTCC及正常膀胱组织中的表达,并结合临床病理资料分析。【结果】Matriptase在BTCC及正常膀胱黏膜中均有表达;在BTCC中的表达阳性率明显低于正常膀胱组织,差异有统计学意义(P<0.05);膀胱肿瘤中低分化组表达明显低于高分化组,组间差异有统计学意义(P<0.05);不同临床分期、淋巴结转移组间差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】Matriptase在BTCC中的表达与促分化有关,可能是一种分化程度的指标。

跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS3在遗传性耳聋中研究进展

跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS3属于Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)家族成员,具有典型TTSP亚家族结构域,如LDLRA、SRCR结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。TMPRSS3突变能导致非综合征型常染色体隐性遗传性耳聋(DFNB8/10),是发现的第一个与耳聋相关的蛋白酶。

肥大细胞类胰蛋白酶与支气管哮喘

As an important mediator of allergic inflammation, mast cell tryptase is involved in the induction of hypersensitivity, infiltration of inflammatory cells and tissue remodeling in respiratory tract. The effects of tryptase inhibitors on the actions of tryptase show further the potential of tryptase in the pathogenesis of asthma and its inhibitors in the treatment of asthma.

食线虫菌物胞外蛋白酶基因工程研究进展

在病原线虫的生物防治中 ,利用食线虫菌物在侵染过程中分泌的胞外蛋白酶 (重要毒力因子 )固定线虫并降解线虫体壁显示出巨大的潜力。综述了近年来食线虫菌物胞外蛋白酶的研究概况、目前开展蛋白酶基因工程研究存在的问题及解决策略 ;对真菌胞外蛋白酶应用于线虫生防和生物医药领域中的前景也进行了评述。

高致病性2型猪链球菌截短型类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶基因的鉴定和功能研究

【目的】克隆表达高致病性2型猪链球菌05ZYH33株的SspA截短型基因,验证其是否具有酶学活性,并构建该基因的缺失突变株细菌,探讨其在2型猪链球菌致病过程中所起的作用【。方法】构建SS2的SspA截短型基因05SSU0811原核表达质粒,表达并纯化05SSU0811蛋白,运用丝氨酸蛋白酶底物Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(pNa),通过显色反应检测表达产物的酶学活性;运用同源重组技术敲除05SSU0811基因,多重交叉PCR筛选敲除株并测序鉴定,动物试验分析05SSU0811基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】成功表达并纯化05SSU0811蛋白,浓度约为3.5 g/L。丝氨酸蛋白酶活性测定试验证实其具有酶学活性;获得05SSU0811基因缺失突变株,小鼠攻毒试验表明,野生株攻毒的20只小鼠全部死亡,基因缺失突变株攻毒组死亡9只,死亡率45%,两组间死亡率有显著性差异。表明05SSU0811基因缺失的菌株毒力较野生株明显下降。【结论】05SSU0811基因编码的截短型丝氨酸蛋白酶仍然具有酶学活性,SS2的截短型基因SspA在高致病性2型猪链球菌的致病性方面具有一定作用。

基质金属蛋白酶9的研究进展

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)属锌依赖性内肽酶家族,是自然界进化中高度保守的一类蛋白酶;其与丝氨酸蛋白酶类、半胱氨酸蛋白酶类共同构成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)三大类降解酶。MMPs与ECM相互作用参与并影响机体众多生理活动。

HtrA丝氨酸蛋白酶1基因c.821G>A杂合突变致遗传性脑小血管病一家系研究

目的研究HtrA丝氨酸蛋白酶1(HTRA1)基因杂合突变致遗传性脑小血管病的临床表型、影像特点、分子遗传学特征及其可能致病机制。方法对2018年3月河南省人民医院神经内科收治的一个中国汉族携带HTRA1基因杂合突变的脑小血管病家系临床资料进行回顾性分析,并对其家系成员进行调查,总结其临床、影像特点,采用多种高通量测序方法捕获及Sanger测序验证,绘制家系图,进行蛋白3D模型构建、突变功能预测、致病性分析,查阅相关文献,探讨其发病机制。结果家系图提示该家系呈常染色体显性遗传模式,3代中共3人发病。先证者39岁起病,首发症状为复视,伴随反复卒中样发作、认知能力下降并出现情绪障碍,不伴脱发。头颅MRI提示双侧脑白质弥漫性、对称性病变,多发腔隙性梗死灶、血管周围间隙和微出血。其四姐46岁起病,首发症状为左侧肢体无力,其他临床与影像学特征与先证者类似。先证者母亲因反复卒中于59岁去世。全外显子测序提示先证者及其四姐存在HTRA1基因c.821G>A位点杂合错义突变,查阅相关数据库未见该突变类型报道,为新致病突变。蛋白功能预测提示其为致病性突变。结论HTRA1基因c.821G>A杂合突变可导致常染色体显性遗传性脑小血管病,该遗传类型应引起临床重视。

胃炎、食管炎和食管癌患者血清中人丝氨酸蛋白酶8的表达及临床意义

目的探讨人丝氨酸蛋白酶8(PRSS8)在胃炎、食管炎和食管癌患者血清中的表达情况及意义。方法采集临床诊断为食管炎、食管癌和胃炎患者以及正常人群的血清样本,其中食管炎患者血清样本20例,食管癌患者血清样本6例,胃炎患者血清样本60例,正常血清样本28例。采用酶联免疫吸附法(ELISA)的方法测定各组中PRSS8的表达水平,并将食管炎患者组、食管癌患者组和胃炎患者组分别与正常组相比较。结果各组血清PRSS8表达水平差异有统计学意义(F=13.24,P<0.01)。食管炎患者组PRSS8表达水平[(4.58±1.67)μg/L]高于正常组[(3.52±1.49)μg/L],差异有统计学意义(LSD-t=2.59,P<0.05);食管癌患者组PRSS8表达水平[(5.05±0.57)μg/L]高于正常组[(3.52±1.49)μg/L],差异有统计学意义(LSD-t=2.54,P<0.05);食管癌患者组PRSS8表达水平[(5.05±0.57)μg/L]高于食管炎患者组[(4.58±1.67)μg/L],差异无统计学意义(LSD-t=0.83,P>0.05);胃炎患者组PRSS8表达水平[(5.39±1.04)μg/L]高于正常组[(3.52±1.49)μg/L],差异有统计学意义(LSD-t=6.22,P<0.05)。结论食管炎、食管癌和胃炎患者血清中PRSS8表达水平均增高,提示血清中的PRSS8可能与食管炎、食管癌和胃炎的发生发展相关。

丝氨酸蛋白酶HtrA1在人牙周膜组织中的表达及对人牙周膜细胞增殖的影响

目的观察丝氨酸蛋白酶HtrA1在人牙周膜组织中的表达，探讨其在人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLC）增殖中的作用。方法收集武汉大学口腔医学院口腔颌面外科门诊拔除的12至25岁健康前磨牙6颗和第三磨牙3颗，要求牙根完整、无龋坏和牙周组织炎症，反转录PCR和免疫组化染色方法分别检测HtrA1在人牙周膜组织中的mRNA和蛋白的表达，组织块法体外培养原代hPDLC，甲基噻唑基四唑比色法检测细胞增殖。用慢病毒转染的方法获得HtrA1基因过表达和基因沉默稳定细胞株，并以空载体慢病毒为对照，然后分别在培养的第1、3、5、7、9d，细胞计数CCK．8试剂盒（cell countingkit-8，CCK-8）检测HtrA1对hPDLC增殖的影响。结果反转录PCR结果显示HtrA1 mRNA在人牙周膜组织中呈阳性表达，免疫组化染色结果显示HtrA1蛋白在人牙周膜组织中也呈阳性表达，并主要表达于hPDLC胞质和胞外基质中。hPDLC经体外培养后生长曲线符合该细胞生长特征。慢病毒成功将HtrA1基因过表达和基因沉默后，CCK．8检测结果显示体外培养1、3、5、7、9d后，分别与各自的空载体对照组相比，过表达HtrA1使hPDLC的增殖速率显著减弱（A值分别为0．897±0．060、0．890±0．083、1．631±0．038、1．111±0．041、1．110±0．189），而基因沉默HtrA1后hPDLC增殖速率显著加快（A值分别为0．329±0．021、0．529±0．044、0．973±0．056、1．626±0．102、2．344±0．198）（P〈0．05）。结论HtrA1在mRNA和蛋白水平均表达于人牙周膜组织中，并对hPDLC的增殖起重要调节作用。

小干扰RNA介导丝氨酸蛋白酶HtrA1沉默对光损伤人视网膜色素上皮细胞的影响

目的 观察丝氨酸蛋白酶HtrA1沉默对光损伤人视网膜色素上皮（RPE）细胞的影响。方法 体外培养人RPE细胞，取第8～12代生长良好的传代细胞用于实验。将细胞分为正常对照组、光损伤模型组。采用波长400 nm的蓝色节能灯以（2000±500） Lux持续光照RPE细胞6 h建立光损伤模型。建模后光损伤模型组再分为针对HtrA1的小干扰RNA（HtrA1 siRNA）组、阴性对照组、空白对照组。应用脂质体RNAimax将HtrA1 siRNA转染至HtrA1 siRNA组细胞；阴性对照组细胞转染非特异的阴性siRNA；空白对照组为单纯光损伤细胞。采用细胞计数试剂盒、transwell小室法及流式细胞仪检测各组细胞增生、迁徙、凋亡以及细胞周期情况；实时聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法检测细胞中HtrA1和血管内皮生长因子A（VEGF-A）mRNA、蛋白质表达。结果 光损伤模型组细胞中HtrA1 mRNA、蛋白表达均较正常对照组细胞明显升高，差异有统计学意义（t=17.62、15.09，P＜0.05）。与阴性对照组、空白对照组比较，HtrA1 siRNA组细胞增生（t=6.37、4.52）、迁徙能力（t=9.56、12.13）、凋亡率（t=23.37、29.08）明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；细胞停留在G0/G1期数目增多（t=6.24、4.93），差异有统计学意义（P＜0.05）；HtrA1、VEGF-A mRNA（t=17.36、11.32、7.29、4.05）和蛋白（t=12.02、15.28、4.98、6.24）表达均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 特异性沉默HtrA1基因表达可降低蓝光对人RPE细胞增生、迁徙能力的损伤和细胞凋亡率；下调VEGF-A的表达。

犬小孢子菌丝氨酸水解酶家族1蛋白的亚细胞定位分析

目的对丝氨酸水解酶家族1(FSH1)蛋白在犬小孢子菌中进行亚细胞定位分析。方法以前期构建的犬小孢子菌FSH1质粒及载体pCAMBIA-LRP-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为模板,PCR扩增FSH1基因及EGFP基因;同时利用SnaBI/KpnI对pCAMBIA-LRP-EGFP质粒双酶切获得载体DNA,将扩增的EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得EGFP表达载体;将扩增的FSH1基因及EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得融合载体Ptrcp-FSH1-EGFP-Ttrcp。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,用重组质粒转化犬小孢子菌,使融合基因FSH1-EGFP在真菌通用启动子(Ptrpc)和终止子(Ttrpc)调控下在犬小孢子菌中整合型表达,利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果成功构建根癌农杆菌转化系统及犬小孢子菌EGFP表达载体;融合基因FSH1-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达。激光共聚焦显微镜显示FSH1-EGFP融合蛋白的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中。结论FSH1-EGFP融合蛋白成功定位于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中,为进一步明确犬小孢子菌FSH1基因的功能及致病机制奠定了基础。

成纤维细胞活化蛋白与肿瘤

成纤维细胞活化蛋白 (FAP)是基质中活化成纤维细胞表达的一种表面抗原 ,为Ⅱ型膜结合蛋白 ,属于丝氨酸蛋白水解酶家族 ,具有二肽肽酶 (DPP)活性和胶原酶活性 ,可水解二肽肽酶、明胶和Ⅰ型胶原 ,在肿瘤的生长、侵袭和转移中发挥着重要作用。成纤维细胞活化蛋白还可以辅助临床诊断 。

HtrA1在子痫前期孕妇血清、胎盘组织中的表达及意义

目的:探讨HtrA1(high temperature requirement A1)在子痫前期孕妇血清、胎盘组织中的表达及意义。方法:HtrA1属分泌型蛋白,可采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定同期住院孕妇的空腹血清HtrA1浓度,其中正常晚期妊娠30例、轻度子痫前期25例、重度子痫前期20例;同时应用免疫组化SABC法检测胎盘组织中HtrA1的表达。结果:正常晚期妊娠、轻度子痫前期及重度子痫前期孕妇血清HtrA1浓度分别为(160.63±32.52)pg/ml、(210.82±32.52)pg/ml及(233.68±38.61)pg/ml,组间差异显著(P<0.05);正常晚期妊娠、轻度子痫前期及重度子痫前期孕妇胎盘组织中HtrA的平均灰度值分别为156.03±5.07、149.89±2.69及140.05±4.96,组间差异显著(P<0.05)。结论:随着病情加重,孕妇血清及胎盘组织中HtrA1的表达显著增高。HtrA1与子痫前期的发生、发展有关。