雷公藤甲素通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β通路对MGC803细胞增殖、侵袭与迁移的影响

目的 探讨雷公藤甲素通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β(AKT/GSK-3β)通路对MGC803细胞增殖、侵袭与迁移的影响。方法 体外培养MGC803细胞,确定雷公藤甲素的干预剂量和干预时间。将细胞分为阴性对照组(A组,不进行处理),阳性对照组(B组,10μmol/L顺铂),雷公藤甲素高、中、低剂量组(C组、D组、E组)。干预48 h,采用Transwell法检测细胞侵袭能力,采用划痕试验法检测迁移能力,采用免疫印迹(Western blot)法检测检测相关蛋白的表达。结果 随着雷公藤甲素浓度的增加,MGC803细胞增殖率降低(P <0.05);48 h时半数抑制浓度(IC50)最小,选择干预时间为48 h,C组、D组、E组的干预剂量分别为80,40,20 nmol/L。与B组比较,C组、D组、E组侵袭细胞数、细胞迁移距离及波形蛋白(vimentin),snail,p-AKT/AKT,p-GSK-3β/GSK-3β表达水平均显著升高(P <0.05),上皮钙黏素(E-cadherin)、β-联蛋白(β-catenin)表达水平均显著降低(P <0.05),且呈剂量依赖关系。结论 雷公藤甲素可通过抑制AKT/GSK-3β信号通路而抑制MGC803细胞增殖、侵袭与迁移。

辛开苦降法对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗患者卵巢功能、子宫内膜容受性及磷脂酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的 观察辛开苦降法对多囊卵巢综合征(Polycystic ovarian syndrome,PCOS)胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)患者卵巢功能、子宫内膜容受性及磷脂酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase/serine threonine protein kinase,PI3K/AKT)通路的影响。方法 选取2018年11月—2020年1月期间四川中医药高等专科学校附属绵阳市中医医院收治的PCOS-IR患者83例,按随机数字表法分为对照组41例和治疗组42例。对照组采用炔雌醇环丙孕酮联合二甲双胍治疗,治疗组采用中医辛开苦降法(中药),均连续治疗12周。观察比较两组患者治疗前后体质量指数(Body mass index,BMI)、卵巢功能[卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)、LH/FSH与抗缪勒管激素(Anti-mullerian hormone,AMH)]、血糖[空腹胰岛素(Fasting insulin,FIN)、空腹血糖(Fasting blood glucose,FPG)、餐后2 h血糖(2 hours postprandial blood glucose,2 h PBG)与胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessmentinsulin resistance,HOMA-IR)]、子宫内膜容受性[收缩期峰值流速(Vmax)、搏动指数(Pulse index,PI)、阻力指数(Resistance index,RI)、血流参数血管化指数(Vascularity index,VI)、血流指数(Flow index,FI)与血管化血流指数(Vascularity flow index,VFI)]、外周血PI3K/AKT通路(PI3K、AKT mNRA),治疗期间不良反应情况。结果 治疗后两组患者BMI、FPG、FIN、2 h GLU、HOMA-IR水平均较治疗前明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);且治疗组BMI、FPG、FIN、2 h GLU、HOMA-IR水平均明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后两组患者AMH、LH、LH/FSH水平均较治疗前降低,差异有统计学意义(P<0.05);FSH较治疗前无显著变化,差异无统计意义(P>0.05);且治疗组AMH、LH、LH/FSH明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后两组患者子宫内膜厚度、子宫容积、Vmax、VI、FI、VFI均较治疗前明显升高,PI、RI均较治疗前降低,差异有统计学意义(P<0.05);且治疗组子宫内膜厚度、子宫容积、Vmax、VI、FI、VFI均明显高于对照组,PI、RI均明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后两组患者PI3K、AktmRN表达均较治疗前升高,差异有统计学意义(P<0.05);且治疗组PI3K、AktmRN表达均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗期间,两组患者均未发生严重不良反应。结论 中医辛开苦降法不仅能改善PCOS-IR患者胰岛素抵抗,还可改善其卵巢功能、子宫内膜容受性,激活PI3K/AKT通路,安全性高。

丝/酪氨酸蛋白激酶PIM3在小鼠眼部组织的表达及分布

目的探讨丝/酪氨酸蛋白激酶PIM3在小鼠眼部组织中的表达。方法应用逆转录-聚合酶链反应及免疫组化检测PIM3在小鼠眼部组织中的表达。结果逆转录-聚合酶链反应可在正常C57/BL小鼠全眼球及角膜中检测到PIM3 mRNA的表达。免疫组化染色显示在小鼠眼部角膜上皮细胞、视网膜及眼外肌中有PIM3蛋白的表达。结论正常小鼠眼部有PIM3基因及蛋白水平的表达,提示PIM3可能在眼部具有一定的功能。

磷脂酰肌醇-3-激酶/丝-苏氨酸蛋白激酶在帕妥珠单抗耐药机制中的作用

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/丝-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)在帕妥珠单抗耐药机制中的作用。方法建立人乳腺癌细胞株Hs578T耐帕妥珠单抗的耐药亚株Hs-Her,(FISH)法分析耐药细胞株Her表型;MTT法检测帕妥珠单抗对Hs578T和Hs-Her细胞增殖的抑制情况;流式细胞术检测帕妥珠单抗干预后细胞凋亡情况;PI3K/Akt抑制剂干预细胞后Western印迹检测细胞P-Akt蛋白表达情况。结果本实验建立的耐药亚株Hs-Her基因表达FISH检测呈强阳性;0.1~100 mg/L浓度帕妥珠单抗干预72 h后,Hs578T和Hs-Her细胞体外增殖均受到抑制,且随帕妥珠单抗浓度的增加而提升,其中Hs578T的IC50值明显低于Hs-Her(P<0.01);10 mg/L的帕妥珠单抗干预后Hs578T细胞凋亡率明显高于Hs-Her细胞(P<0.01)。预先经PI3K/Akt抑制剂处理后再加入帕妥珠单抗,Hs578T和Hs-Her细胞均发生明显凋亡,差异无统计学意义(P>0.05)。Western印迹检测显示,帕妥珠单抗可有效抑制Hs578T细胞Akt蛋白磷酸化,却无法抑制Hs-Her细胞Akt蛋白磷酸化;PI3K/Akt信号通路抑制剂可同时抑制Hs578T和Hs-Her细胞的Akt蛋白磷酸化。结论帕妥珠单抗耐药细胞Hs-Her存在Akt蛋白磷酸化,PI3K/Akt抑制剂可明显抑制帕妥珠单抗耐药细胞Akt蛋白磷酸化;PI3K/Akt信号通路与帕妥珠单抗耐药性存在明确相关性。

长非编码RNA 00467基于竞争性内源RNA调控丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3基因参与胶质瘤细胞免疫及耐药的机制

目的探讨胶质瘤细胞中长非编码RNA 00467(LINC00467)通过竞争性内源RNA(ceRNA)机制调控丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3基因(RIPK3)与肿瘤微环境(TME)及药敏性的关系及其机制。方法对癌症基因组图谱(TCGA)数据库和基因型-组织表达(GTEx)数据库胶质瘤及正常脑组织基因表达进行分析,筛选差异表达基因(DEGs)(P<0.01且表达变化大于2倍的基因),确定有意义的长链非编码RNA(lncRNA)-mRNA关系对,进行生存分析。在Starbase v3.0数据库中筛选微小RNA(miRNA,miR)-lncRNA关系对,确定ceRNA。在metascape、TISCH、CancerSEA数据库进行分析。取25例新鲜胶质瘤组织及25例正常脑组织,应用荧光实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测基因表达。应用R软件包及SPSS统计分析软件对结果进行处理。结果对TCGA和GTEx表达谱进行差异表达分析,发现6095个差异表达的lncRNA(3083上调,3012下调)和10164个差异表达的mRNA(6803上调,3361下调)。对胶质瘤中的319795对候选lncRNA-mRNA对进行筛选,确定LINC00467-RIPK3为研究对象,发现LINC00467、RIPK3在胶质瘤组织高表达,且呈正相关(r=0.66,P<0.01)。数据库分析发现RIPK3可能通过海绵吸附miR-3612与LINC00467形成ceRNA。生存分析显示LINC00467-RIPK3高表达的患者预后较差(P<0.05)。胶质瘤单细胞数据集分析发现RIPK3在巨噬细胞中高表达,bulk数据集分析发现RIPK3与巨噬细胞表面分子表达正相关(P<0.01)。应用使用表达数据估计恶性肿瘤中的间质和免疫细胞算法计算胶质瘤患者的免疫得分,分析发现RIPK3与Estimate、基质计分、免疫计分以及肿瘤纯度显著相关(P<0.01)。药敏数据分析显示,RIPK3的表达与多种药物的半数抑制浓度(IC50)值有关(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,胶质瘤组织中LINC00467、RIPK3的表达水平高于正常组织(0.74±0.28、0.34±0.20,t=8.94、9.38,P<0.01),而胶质瘤组织miR-3612的表达水平(0.57±0.27)低于正常组织(0.79±0.33,t=-2.17,P<0.01)。结论LINC00467可能通过ceRNA机制促进RIPK3表达而参与胶质瘤TME和药敏性调控。

嗜酸乳杆菌胞外蛋白调控MAPK和PI3K-AKT信号途径关键蛋白活化水平

探讨并揭示嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CICC6005分泌的相关蛋白质促进肠道健康及分子机制具有重要研究价值。本实验在确定了L.acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白抑制HT-29结肠癌细胞增殖的基础上,进一步探讨67 ku和37 ku的胞外蛋白通过何种途径发挥抑制结肠癌细胞增殖。研究以HT-29细胞作为靶细胞,用丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B,PI3K-AKT)信号通路为考察对象,以Western Blotting为手段,分析两个通路中关键的靶点蛋白p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、磷酸化p38(phosphorylated p38,p-p38)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)、磷酸化的细胞外信号调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated AKT,p-AKT)、PI3K的表达水平,以探讨并阐述源于L.acidophilus CICC6005胞外蛋白调控结肠癌细胞增殖状况的分子机制。结果表明,不同质量浓度的67 ku和37 ku胞外蛋白分别作用HT-29细胞一定时间后,两种胞外蛋白均具有下调两个信号通路途径中p-ERK1/2、p-p38、p-AKT、PI3K蛋白的表达,且存在浓度依赖关系;但对p-JNK、ERK1/2、p38、JNK蛋白的表达没有影响。因此,源于L.acidophilus CICC6005分泌的37 ku和67 ku胞外蛋白表现出显著的抑制HT-29细胞增殖的功能,其机制可能与调控MAPK和PI3K-AKT两个信号通路中几个关键的靶点蛋白的活化水平相关。该研究结果提示,食用嗜酸乳杆菌其分泌的胞外蛋白质将达到维护肠道健康的目标。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3基因在胶质瘤中的表达及分子调控机制

目的通过分析网络生物数据探讨丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)基因在胶质瘤中的表达及分子调控机制。方法应用Gepia2数据库对进行TCGA肿瘤数据和GTEx正常数据联合分析,筛选差异表达基因,进一步对RIPK3基因的调控机制进行分析。荧光实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测20例胶质瘤组织及正常组织中RIPK3 mRNA、FGD5-AS1、微小RNA(miR)-223-3p的表达,对其关系进行分析。结果Gepia2分析显示,胶质瘤和正常组织中存在7659个差异表达基因。差异表达结果发现RIPK3 mRNA在胶质瘤组织中表达水平(1.862±1.621)显著高于正常组织(0.693±0.801,Z=9.067,P<0.01)。应用STRING数据库分析RIPK3的PPI网络进行富集分析,结果显示RIPK3互相作用的蛋白参与半胱氨酸型内肽酶(cysteine-type endopeptidase)活性、核因子-κB(NF-κB)信号通路等的调控。长非编码RNA FGD5-AS1在胶质瘤中表达水平(6.401±0.683)高于正常组织(5.406±0.796,t=12.697,P<0.01),并与RIPK3呈正相关(rs=0.402,P<0.01);数据库分析显示RIPK3与FGD5-AS1互为内源性竞争RNA(ceRNA),通过miR-223-3p发挥作用。对FGD5-AS1、miR-223-3p、RIPK3 mRNA在胶质瘤及正常组织中表达检测的RT-qPCR结果显示,FGD5-AS1、RIPK3 mRNA在胶质瘤组织中表达水平(1.942±0.695、1.392±0.360)均高于正常组织(0.533±0.208、0.293±0.144,t=8.686、12.676,P<0.01),而miR-223-3p在胶质瘤组织中表达水平(0.843±0.213)低于正常组织(2.334±0.758,t=-8.469,P<0.01)。在胶质瘤组织中RIPK3 mRNA与FGD5-AS1表达呈正相关(rs=0.840,P<0.01),RIPK3 mRNA、FGD5-AS1与miR-223-3p表达呈负相关(rs=-0.914、-0.872,P<0.01)。结论RIPK3在胶质瘤组织中呈高表达,与胶质瘤进展有关。FGD5-AS1可能通过内源性竞争机制通过抑制miR-223-3p而调控RIPK3的表达。

黄连素对阿尔兹海默症大鼠学习记忆功能及海马组织GSK3β、p-Tau蛋白表达的影响

目的探究不同剂量黄连素对阿尔兹海默症大鼠学习和认知功能的影响,以及黄连素对丝氨酸蛋白激酶3β(serine protein kinase 3β,GSK3β)、p-Tau蛋白表达的影响。方法大鼠分为假手术组、模型组、黄连素低中高剂量组,除假手术组外,其余各组采用腹腔注射D-半乳糖联合Aβ25-35脑注射的方法建立阿尔兹海默症模型大鼠,药物干预4周后,检测Morris水迷宫实验、海马组织GSK3β、p-Tau蛋白表达量。结果与模型组相比,黄连素治疗组大鼠逃避潜伏期、游泳总路程不同程度降低,穿越目标区域次数增加,其中黄连素高剂量组降低最显著(P<0.01,P<0.05)。黄连素组海马GSK3β、p-Tau蛋白表达较模型组显著降低,高剂量组降低最显著(P<0.01)。结论黄连素能改善阿尔兹海默症大鼠学习和记忆能力,其中150 mg/kg黄连素对善阿尔兹海默症大鼠治疗效果优于50 mg/kg及100 mg/kg,其机制与黄连素降低大鼠海马组织GSK3β、p-Tau蛋白表达有关。

丙泊酚对乳腺肿瘤细胞磷脂酰肌醇3-激酶／丝氨酸蛋白激酶信号通路的影响

目的观察丙泊酚对乳腺癌肿瘤细胞Michigan Cancer Foundation-7（MCF-7）细胞表面γ-氨基丁酸受体介导的磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信号通路的影响，探讨其对乳腺癌细胞的增殖是否存在抑制作用。方法依据丙泊酚浓度分为100 μmol/L丙泊酚组、300 μmol/L丙泊酚组、1 mmol/L丙泊酚组、3 mmol/L丙泊酚组，设置无丙泊酚干预的空白对照组及不同浓度丙泊酚＋γ-氨基丁酸拮抗剂荷包牡丹碱干预组，运用全细胞膜片钳技术观察不同浓度丙泊酚干预组、对照组及丙泊酚联合γ-氨基丁酸拮抗剂组对MCF-7细胞的细胞膜表面氯离子通道的影响；用蛋白印迹法检测MCF-7细胞内PI3K/Akt信号通路中Akt蛋白的表达；噻唑蓝（MTT）法检测丙泊酚对MCF-7细胞存活率的影响，并进行比较。结果（1）随着细胞膜电位的升高，丙泊酚呈浓度依赖性刺激MCF-7细胞氯离子的电流强度，3 mmol/L丙泊酚组电流强度为（40.13±9.21） Pa，较对照组的MCF-7细胞氯离子的电流强度（19.46±8.53） Pa相差最大，差异有统计学意义（P＝0.032）；加入γ-氨基丁酸拮抗剂荷包牡丹碱后，丙泊酚对MCF-7细胞氯离子的电流强度的影响减弱，3 mmol/L丙泊酚组电流强度为（16.92±7.47） Pa其与对照组（18.61±8.19） Pa之间差异无统计学意义（P＝0.063）；（2）Western blot法检测显示丙泊酚对MCF-7细胞PI3K/Akt信号通路中Akt蛋白表达有抑制作用；（3）随着丙泊酚浓度的增高，其对MCF-7细胞的生存抑制越强。（4）经丙泊酚培养72 h的乳腺癌组织经苏木素-伊红（HE）染色观察发现肿瘤细胞数较对照组少。 结论高浓度的丙泊酚通过刺激MCF-7细胞氯离子通道的开放，加强其与乳腺癌细胞表面的γ-氨基丁酸受体的作用，从而抑制PI3K/Akt信号通路的活性，最终抑制乳腺癌细胞的增殖。

人参皂苷Rg3对人肝癌细胞Pim-3及Bad凋亡蛋白表达的影响

目的:研究人参皂苷Rg3对人肝癌细胞SMMC-7721中Pim-3及磷酸化Bad蛋白pBad(Ser112),pBad(Ser136)表达的影响.方法:用浓度为0、5、10、20、40和80μmol/L的人参皂苷Rg3处理SMMC-7721细胞24h后.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测人参皂苷Rg3对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用,倒置显微镜和流式细胞术观察人参皂苷Rg3对SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用,Westernblot方法检测不同浓度人参皂苷Rg3处理后SMMC-7721细胞中Pim-3,pBad(Ser112)和pBad(Ser136)的表达情况.结果:5、10、20、40和80μmol/L的人参皂苷Rg3对SMMC-7721细胞增殖的抑制率分别为4.69%、15.53%、22.17%、50.97%、61.65%.5-80μmol/L的人参皂苷Rg3处理细胞呈现明显的凋亡形态学改变,80μmol/L人参皂苷Rg3处理SMMC-7721细胞24h后,处理组比正常对照组凋亡明显增加,差异有统计意义(16.5%±4.3%vs0.4%±1.3%,P<0.01).人参皂苷Rg3对细胞中Bad总蛋白的表达没有明显影响.Pim-3的表达随人参皂苷Rg3浓度的增加而逐渐减弱,而pBad(Ser112)的表达随人参皂苷Rg3浓度的增加而逐渐增强;pBad(Ser136)不表达.结论:人参皂苷Rg3的抗癌活性与其促进磷酸化Bad蛋白表达有关.

丁苯酞对阿尔茨海默病模型大鼠海马CA1区GSK-3β及p-Tau蛋白表达的影响

目的观察丁苯酞(NBP)软胶囊对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠海马CA1区丝氨酸蛋白激酶-3β(GSK-3β)、p-Tau蛋白表达的影响,探讨NBP治疗AD的机制。方法将72只雄性SD大鼠随机分为假手术组(24只)、AD模型组(24只)、NBP治疗组(24只)。采用β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)制作AD模型,假手术组注射5μL生理盐水。造模成功后4周,NBP治疗组给予NBP与食用油混合后制成的NBP混合溶液灌胃;假手术组和AD模型组采用同等剂量的食用油进行灌胃。采用Morris水迷宫实验比较各组大鼠穿越平台次数。采用Western blot法分别于给药后1、2、4和8周检测海马CA1区GSK-3β、p-Tau蛋白的表达情况。结果与假手术组比较,AD模型组大鼠各时间点穿越平台次数显著减少(均P<0.05);与AD模型组比较,NBP治疗组各时间点大鼠穿越平台次数均增加(均P<0.05);与假手术组同期比较,AD模型组大鼠海马CA1区p-Tau、GSK-3β蛋白相对表达水平升高,差异有高度统计学意义(P<0.01);与AD模型组同期比较,NBP治疗组大鼠海马CA1区p-Tau、GSK-3β蛋白相对表达水平降低,差异有高度统计学意义(P<0.01);与假手术组同期比较,NBP治疗组大鼠海马CA1区p-Tau、GSK-3β蛋白相对表达水平升高,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论NBP可通过下调GSK-3β、p-Tau蛋白的表达,发挥对AD模型大鼠的脑保护作用。

人参皂苷Rg3对人胃癌细胞Pim-3及Bad凋亡蛋白表达的影响

目的研究人参皂苷Rg3对人胃癌细胞株MKN28中Pim-3及磷酸化Bad蛋白pBad(Ser112),pBad(Ser136)表达的影响。方法用浓度为0,10,20,40和80μmol/L的人参皂苷Rg3处理MKN28细胞24h后。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测人参皂苷Rg3对MKN28细胞增殖的抑制作用,倒置显微镜和流式细胞术观察人参皂苷Rg3对MKN28细胞凋亡的诱导作用,Westernblot方法检测经不同浓度人参皂苷Rg3处理后MKN28细胞中Pim-3,pBad(Ser112)和pBad(Ser136)的表达情况。结果10,20,40和80μmo1/L的人参皂苷Rg3对MKN28细胞增殖的抑制率分别为18.70,34.06,54.49,69.28%。10～80μmol/L的人参皂苷Rg3处理细胞呈现明显的凋亡形态学改变,80μmol/L人参皂苷Rg3处理MKN28细胞24h后,凋亡细胞占(12.23±2.1)%,处理组比正常对照组(3.28±1.7)%凋亡明显增加,差异有统计意义(P<0.01)。Bad总蛋白表达没有明显影响。pim-3和pBad(Ser112)的表达均随人参皂苷Rg3浓度的增加而逐渐减弱。pBad(Ser136)不表达。结论人参皂苷Rg3的抗癌活性与其调节Pim-3以及磷酸化Bad蛋白表达有关;Pim-3可磷酸化Bad抑制胃癌细胞的凋亡。

猪精氨酸-丝氨酸蛋白激酸3(SRPK3)基因的克隆、表达及多态性分析(英文)

通过对猪SRPK3基因初步的研究,为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息,为猪的遗传育种提供分子标记。以大白猪为实验材料,采用RT-PCR方法克隆了精氨酸-丝氨酸蛋白激酶3(serine/arginine-rich specific kinase 3,SRPK3)的全长基因CDS区;采用生物信息学方法分析了SRPK3基因核酸序列并对其所编码的的蛋白序列进行了预测与分析编码蛋白序列的结构特点;采用PCR-SSCP方法对大白猪,野猪,民猪及野家杂交猪的SRPK3基因的多态性进行了检验;采用实时荧光定量PCR(Real-time)方法检测了SRPK3在1日龄和30日龄大白猪及杜洛克的心脏、肌肉、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、小肠、大肠、脑的表达情况;采用皮下注射的方式构建猪骨骼肌损伤模型用于研究在骨骼肌修复过程中SRPK3基因表达特性。经拼接所得到的1 708bp核苷酸片段,涵盖了SRPK3基因的全长CDS(1 701bp),该基因编码含567个氨基酸片段;蛋白存在两个S_TKc结构域,猪SRPK3蛋白序列与人和牛的相似性较高。PCR-SSCP检测发现第6外显子上A629→G629,T653→T653的突变,氨基酸变化为Pro→His,Ile→Thr;第9外显子处的G1059→A1059,氨基酸无突变。利用荧光定量PCR研究发现,表达结果显示该基因表达具有组织和种间特异性。SRPK3基因的表达在整个骨骼肌细胞损伤修复过程中逐渐升高。SRPK3基因主要在肌肉和心肌内表达,骨骼肌损伤修复过程中伴随骨骼肌细胞分化SRPK3的表达持续升高,推测其可能与骨骼肌细胞发育相关。

PI3K/AKT/GSK-3β信号在脑缺血预处理中的作用及对海马细胞凋亡的影响

目的研究脑缺血预处理(CIPC)中PI3K/AKT/GSK-3β信号通路调节变化及对海马细胞凋亡的影响。方法制作脑缺血、CIPC及LY294002干预模型。进行神经功能缺损评分;TTC染色计算脑梗死体积;TUNEL法检测海马细胞凋亡;Western blot检测p-PDK1、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β(ser9)、Mc-l1的蛋白表达,RT-PCR检测GSK-3β的转录。结果①与脑缺血组比较,CIPC组在神经功能缺损评分、脑梗死体积、细胞凋亡、GSK-3β蛋白表达及转录水平均降低(均P<0.05),但脑缺血组与LY294002组比较,上述各检测值差异均无统计学意义(均P>0.05);②与脑缺血组比较,CIPC组的p-PDK1、p-AKT、p-GSK-3β(ser9)、Mc-l1的蛋白表达均增高,LY294002组各蛋白表达较CIPC组均降低(均P<0.05),LY294002组与脑缺血组比较各蛋白表达差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论脑缺血预处理降低GSK-3β的转录和蛋白表达,增加p-PDK1、p-AKT、p-GSK-3β(ser9)、Mc-l1的表达,减少神经元凋亡。LY294002可抵消脑缺血预处理的保护作用。

右美托咪定对呼吸机相关性肺损伤大鼠肺组织内质网应激的影响及PI3K/Akt 信号通路的关系

目的探讨右美托咪定(DEX)对大鼠呼吸机相关性肺损伤(ventilator associated lung injury,VALI)时内质网应激(ERS)诱导的细胞凋亡及磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路的影响。方法将80只SD大鼠采用随机数字表法分为四组(n=20):对照组(C组)、机械通气组(V组)、右美托咪定组(D组)和右美托咪定+PI3K/Akt信号转导通路抑制剂(LY294002)组(DL组)。C组不行机械通气,自主呼吸空气;V组、D组、DL组机械通气4h,机械通气前20minD组静脉输注右美托咪定5.0μg/kg,机械通气期间以5.0μg/(kg·h)的速率静脉输注;DL组在给予右美托咪定前5min静脉输注LY2940020.3mg/kg;V组给予等容量生理盐水。机械通气4h时处死大鼠,测定肺通透指数(LPI)与肺湿/干质量(W/D)比值。采用蛋白质印迹(Westernblot)法检测Akt、磷酸化Akt(P-Akt)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase-12)的表达水平。光镜下观察肺组织病理学结果,测定肺泡损伤率(IAR),采用原位末端标记技术(TUNEL)法观察肺组织细胞凋亡情况并计算凋亡指数(AI)。结果与C组比较,V组与DL组W/D比、LPI、IAR(%)、AI(%)明显升高,GRP78、CHOP、caspase-12表达升高(C组:0.35±0.02、0.28±0.02、0.51±0.03;V组:1.27±0.11、1.09±0.13、1.37±0.15;DL组:0.97±0.08、0.66±0.07、1.01±0.09;P<0.05),P-Akt表达降低(C组:0.81±0.04;V组:0.23±0.01;DL组:0.44±0.02;P<0.05);与V组比较,DL组与D组W/D比、LPI、IAR(%)、AI(%)明显降低,GRP78、CHOP、caspase-12表达降低(V组:1.27±0.11、1.09±0.13、1.37±0.15;DL组:0.97±0.08、0.66±0.07、1.01±0.09;D组:0.62±0.04、0.43±0.05、0.79±0.07;P<0.05),P-Akt表达升高(V组:0.23±0.01;DL组:0.44±0.02;D组:0.65±0.03;P<0.05)且肺组织病理损伤减轻;与D组比较,DL组W/D比、LPI、IAR(%)、AI(%)明显升高,GRP78、CHOP、caspase-12表达升高(D组:0.62±0.04、0.43±0.05、0.79±0.07;DL组:0.97±0.08、0.66±0.07、1.01±0.09;P<0.05),P-Akt表达降低(D组:0.65±0.03;DL组:0.44±0.02;P<0.05),肺组织病理损伤较重。结论右美托咪定可减轻大鼠VALI,与其激活PI3K/Akt信号通路,抑制ERS,减少肺组织细胞凋亡有关。

核受体NR6A1通过上调RIPK3基因表达诱导血管平滑肌细胞凋亡

目的:探讨核受体亚家族6A1(NR6A1)对血管平滑肌细胞凋亡的影响及可能的分子机制。方法:将腺病毒Ad-NR6A1感染大鼠血管平滑肌细胞,分别在感染后0 h、24 h和48 h时进行MTT实验,以时间为横坐标,A570为纵坐标绘制细胞生长曲线,观察NR6A1对细胞生长的影响;进行DAPI染色、TUNEL染色及caspase活性检测,观察细胞凋亡情况;进一步通过基因芯片技术,寻找NR6A1的靶基因;采用siRNA介导的基因沉默技术,观察受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)基因沉默对NR6A1诱导的血管平滑肌细胞凋亡的影响。结果:腺病毒Ad-NR6A1感染细胞48 h时,NR6A1过表达组细胞数量较对照组(重组腺病毒载体Ad-Lac Z)明显减少;DAPI染色显示NR6A1过表达诱导血管平滑肌细胞出现核浓缩和核碎裂的凋亡表型,TUNEL染色显示NR6A1过表达引起细胞凋亡,caspase活性检测结果显示NR6A1过表达细胞内caspase-3、caspase-8和caspase-9活性均较对照组高;基因芯片技术检测发现,NR6A1过表达上调血管平滑肌细胞中RIPK3基因表达;RIPK3基因沉默可以显著抑制NR6A1诱导的平滑肌细胞凋亡。结论:NR6A1通过上调RIPK3基因表达诱导血管平滑肌细胞凋亡。

电项针对全脑缺血VD模型大鼠PI3K/AKT/GSK-3β信号通路的影响

目的研究电项针对全脑缺血血管性痴呆(vascular dementia,VD)模型大鼠磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β(Phosphatidylinositol-3 kinase/serine-threonine kinase/glycogen synthase kinase-3β,P13K/AKT/GSK-3β)信号通路的影响。方法采用四血管阻断方法制备VD模型大鼠,电项针组取双侧风池穴、供血穴,电针30 min/次,1次/d,治疗14d。采用Y迷宫评价大鼠学习记忆能力;荧光定量PCR(RT-PCR)、Western blot法检测大鼠海马组织中磷酸化蛋白激酶B(phosphorylatedproteinkinaseB,p-AKT)、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(Phosphorylated GSK-3β,P-GSK-3β)mRNA和p-AKT、p-GSK-3β蛋白的表达。结果与模型组比较,电项针组可显著提高VD大鼠Y迷宫学习与记忆正确次数(P<0.01)。与模型组比较,电项针组大鼠海马组织中p-AKT、p-GSK-3βmRNA和p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达均有不同程度的升高(P<0.01)。结论电项针能够改善VD模型大鼠学习记忆能力,具体机制可能是激活PI3K/AKT/GSK-3β信号通路,发挥抗凋亡作用,起到对缺血海马神经元的保护作用。

血府逐瘀合剂对PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移及PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路的影响

目的:探究血府逐瘀合剂对血小板衍生生长因子(PDGF)-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移及磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/糖元合成酶激酶3β/β-连环蛋白(PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin)信号通路的影响。方法:利用重组鼠PDGF-BB体外刺激大鼠胸大动脉平滑肌细胞A7R5诱导增殖、迁移模型,分为6组:对照组、PDGF-BB组、低剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组、高剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组、PI3K激活剂+PDGF-BB组、PI3K激活剂+高剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组,CCK-8法检测A7R5细胞增殖活力;流式细胞术检测A7R5细胞周期;细胞划痕实验检测A7R5细胞迁移情况;免疫印迹检测A7R5细胞增殖、迁移相关蛋白及PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路相关蛋白。结果:与对照组比较,PDGF-BB组A7R5细胞增殖率、迁移面积、S期比例,PCNA、cyclin D1、MMP9蛋白及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、胞核β-catenin/总β-catenin蛋白比值显著增加,G0/G1期比例、E-cadherin蛋白显著减少(P<0.05);与PDGF-BB组比较,低、高剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组A7R5细胞增殖率、迁移面积、S期比例,PCNA、cyclin D1、MMP9蛋白及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、胞核β-catenin/总β-catenin蛋白比值显著减少,G0/G1期比例、E-cadherin蛋白显著增加,且高剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组优于低剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组(P<0.05);与高剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组比较,PI3K激活剂+高剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组A7R5细胞增殖率、迁移面积、S期比例,PCNA、cyclin D1、MMP9蛋白,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、胞核β-catenin/总β-catenin蛋白比值显著增加,G0/G1期比例、E-cadherin蛋白显著减少(P<0.05)。结论:血府逐瘀合剂可抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移,可能通过抑制PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路而实现。

维泰醇对人骨肉瘤移植荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用及对Akt/GSK3信号通路的影响

目的:探讨维泰醇对人骨肉瘤移植荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用及对丝苏氨酸蛋白激酶(Akt)/糖原合酶激酶3(GSK3)信号通路的影响。方法:将30只BALB/c-nu品系裸鼠分为3组:正常对照组、环磷酰胺组(25 mg·kg^(-1))和维泰醇组(150 mg·kg^(-1)),每组10只。用培养的U-2OS细胞注射到裸鼠右胫骨骨髓腔内制备U-2OS荷瘤裸鼠模型,造模成功后环磷酰胺组和维泰醇组灌胃给予相应药物,正常对照组给予等量生理盐水,1次/d,给药周期为4周。末次给药次日,处死裸鼠,完整剥离出原位瘤块,计算抑瘤率,检测瘤块组织中相关蛋白表达水平及细胞凋亡情况。结果:与正常对照组比较,环磷酰胺组和维泰醇组瘤块重量、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin)、p-Akt、磷酸化糖原合酶激酶3(p-GSK3)和锌指转录因子(Snail)蛋白表达水平降低,抑瘤率、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达水平和细胞凋亡率增加(P<0.05);与环磷酰胺组比较,维泰醇组瘤块重量、N-cadherin、vimentin、fibronectin、p-Akt、p-GSK3和Snail蛋白表达水平增加,抑瘤率、E-cadherin蛋白表达水平和细胞凋亡率降低(P<0.05);各组Akt和GSK3蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:维泰醇可能通过Akt/GSK3信号通路抑制上皮-间质转化(EMT)并降低骨肉瘤细胞的侵袭能力,促进骨肉瘤细胞凋亡。

青藤碱基于CASC11/AKT3轴对脑胶质瘤原位荷瘤裸鼠肿瘤生长及血管生成的抑制作用

目的观察青藤碱对脑胶质瘤原位荷瘤裸鼠肿瘤生长及组织血管生成的抑制作用,并基于癌易感候选基因11(CASC11)/丝氨酸/苏氨酸激酶3(AKT3)探讨相关机制。方法取对数生长期U87-MG细胞,将CASC11过表达质粒CASC11 mimics转染至U87-MG细胞,48 h后用于后续实验。取45只BALB/c裸鼠,随机抽取10只设为空白组;其余25只裸鼠给予U87-MG细胞悬液建立脑胶质瘤原位荷瘤模型,将成功建模的20只裸鼠随机分为脑胶质瘤组、青藤碱组,各10只;剩余的10只裸鼠注射转染48 h后的U87-MG细胞悬液,设为mimics联合青藤碱组。建模完成后7 d,给予青藤碱组、mimics联合青藤碱组裸鼠腹腔注射青藤碱(20 mg/kg),其余组腹腔注射等体量生理盐水。干预14 d后,测定抑瘤率与脾脏指数,检测肿瘤组织的微血管密度和AKT3蛋白的表达量。结果mimics联合青藤碱组、青藤碱组的抑瘤率分别为(30.29±4.46)%、(52.10±6.87)%,前者较后者降低(P<0.05)。与空白组相比,脑胶质瘤组的脾脏指数降低(P<0.05);与脑胶质瘤组比较,青藤碱组的脾脏指数升高,血管密度、AKT3蛋白的表达量均降低(均P<0.05);与青藤碱组比较,mimics联合青藤碱组的脾脏指数降低,血管密度、AKT3蛋白的表达量均升高(均P<0.05)。结论青藤碱可提升脑胶质瘤原位荷瘤裸鼠的免疫功能,抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长,其可能通过抑制CASC11表达进而下调AKT3蛋白表达来发挥作用。