一种新型丝素支架材料的体内降解试验

将制备的冷冻致孔新型丝素支架材料植入兔耳皮下进行体内降解试验,评价丝素支架材料的降解规律以及生物相容性。对植入丝素支架材料的兔耳进行肉眼外观观察、组织切片观察和扫描电子显微镜观察。肉眼外观观察发现植入丝素支架材料部位的皮肤无明显红肿,经过28周左右皮下材料植入部位的突起逐渐消失;组织切片观察发现该丝素支架材料引起的组织反应较弱;扫描电子显微镜在28周时只观察到将近消失的丝素支架材料种植腔,表明材料已基本降解。相比之下28周时丝素膜仍完好,无明显降解。研究结果表明,冷冻致孔新型丝素支架材料有望开发为一种生物相容性优良的可降解吸收性组织工程支架材料。

壳聚糖-丝素支架与真皮间充质干细胞的体外复合培养

背景：壳聚糖与丝素有各自的优点和不足,将两者共混,可取长补短,改善性能。进行壳聚糖-丝素支架与真皮间充质干细胞体外复合培养的研究,可进一步为工程化组织构建打下基础。目的：将壳聚糖-丝素支架与大鼠真皮间充质干细胞体外复合培养,探讨壳聚糖-丝素支架对真皮间充质干细胞吸附、生长及增殖的影响。方法：①壳聚糖和丝素以质量比为3︰7充分搅拌混匀,冻干制作壳聚糖-丝素海绵状支架,并测其孔径、孔隙率等指标。②将该支架与大鼠真皮间充质干细胞复合进行体外培养,倒置相差显微镜观察细胞与支架复合生长、基质形成以及细胞与支架结合的情况。分别于培养6,12,24h消化支架上的细胞,计算细胞吸附率。于培养2,4,6,8,10d后,用MTT法检测细胞增殖率情况。以无支架的细胞培养作为对照组。结果与结论：①倒置相差显微镜及扫描电镜下观察发现该支架有分布较均匀且细密的小孔,孔与孔之间相互连通,孔径大小较均匀,孔径在100~150μm之间,孔隙率为90.3%。②24h内,真皮间充质干细胞对支架的黏附率随着时间的增加而逐渐增高,24h时的黏附率为93%,表明真皮间充质干细胞可良好地黏附于壳聚糖-丝素支架上。③MTT法检测细胞增殖结果显示,于培养各检测时间点,实验组与对照组比较差异均无显著性意义。于培养早期（第2,4天）,对照组增殖细胞数略高于实验组;于培养第10天,实验组的增殖细胞数略高于对照组。倒置相差显微镜观察细胞于支架上的形态和附着良好,并有较旺盛的细胞基质分泌。表明真皮间充质干细胞在该支架上能良好地生长、增殖。提示壳聚糖-丝素支架是真皮间充质干细胞体外培养的良好支架材料。

新型丝素凝胶和丝素支架的生物相容性评价研究

目的:综合评价新型丝素凝胶和丝素支架的生物相容性和生物安全性.方法:采用溶血实验评价丝素凝胶和丝素支架对红细胞功能和代谢的影响;采用皮肤刺激和皮内刺激实验评价丝素凝胶和丝素支架对皮肤的刺激作用;通过热源实验来判断丝素凝胶和丝素支架中所含热源量是否符合人体的要求;通过给小鼠背部皮下植入丝素凝胶和丝素支架,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法分析丝素凝胶和支架对小鼠血清免疫球蛋白IgM和IgG抗体水平的影响、采用液相芯片法分析凝胶和支架对血清炎性细胞因子质量浓度的影响、采用流式细胞法分析丝素凝胶和支架对脾脏和骨髓免疫细胞异常的影响.结果:丝素凝胶和丝素支架的溶血率分别为4.239%和2.312%(均<5%),两种材料不引起溶血反应,并且对红细胞形态无影响;丝素凝胶和丝素支架的皮肤刺激实验和皮内刺激实验的结果均为阴性,表明对皮肤没有刺激作用;热源实验结果显示大白兔体温升高均低于0.6℃,并且体温升高总数低于1.4℃.小鼠皮下分别植入两种材料后结果显示,植入1周和5周后小鼠血清抗IgM抗体水平与阴性对照组无显著性差异,抗IgG抗体水平在植入后1周时与阴性对照组无显著性差异,植入后5周丝素凝胶的IgG抗体水平比阴性对照组显著升高.植入后5周23种小鼠血清细胞因子质量浓度与阴性对照组无显著性差异,脾细胞和骨髓细胞中嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、B细胞、B1细胞、B1a细胞、B2细胞、CD3^(+)T细胞、CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞、巨噬细胞和树突状细胞的表达量均与阴性对照组无显著性差异.结论:新型丝素凝胶和丝素支架无溶血作用,对红细胞形态无影响,对皮肤无刺激作用,所含热源量符合人体要求;体内植入后分子和细胞实验证实新型丝素凝胶和丝素支架不会引起小鼠免疫细胞异常反应,也不会引起抗体异常升高,同时不会导致血清炎性细胞因子质量浓度升高.通过综合评价,显示丝素凝胶和丝素支架具有良好的生物相容性.

多孔转基因丝素支架的制备及性能测试

以2种融合了蜘蛛丝蛋白的转基因蚕丝为材料制备转基因丝素支架,通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)、扫描电子显微镜(SEM)及压缩测试等方法表征转基因丝素支架的结构与性能变化。结果表明,转基因丝素支架的横截面以蜂窝状多孔结构为主,易于细胞的黏附和生长;再生丝素蛋白结构发生变化,β折叠结构含量提高了16.14%;力学性能得到改善,压缩模量和抗压强度分别提高了24.49%和38.11%。体外细胞培养验证了转基因支架材料生物相容性良好,对细胞增殖没有显著影响,是一种更理想的肌骨组织修复医用备选材料。研究证实了转基因蚕丝应用于再生丝素材料的可行性,为组织工程材料开发提供了新的方向。

丝素胶原蛋白复合支架联合富血小板血浆修复皮肤损伤

背景:胶原与丝素蛋白复合构建的组织工程支架,在皮肤、神经、血管、骨、软骨等组织工程领域应用广泛。富血小板血浆是血液经过2次离心获得的血小板浓缩物,含有多种组织修复需要的生长因子,可促进组织再生与创面愈合。目的:观察丝素胶原蛋白支架复合富血小板血浆在皮肤创面愈合中的作用。方法:分别制备丝素胶原蛋白支架、SD大鼠富血小板血浆。取8周龄SD大鼠48只,每只背部制作2个直径2 cm的全层皮肤缺损创面,分4组处理:空白组缺损处注射生理盐水,单纯支架组缺损处植入丝素胶原蛋白复合支架,富血小板血浆组创缘注射同种异体富血小板血浆,联合组缺损处植入丝素胶原蛋白复合支架+创缘注射同种异体富血小板血浆,每组12只。造模后检测创面愈合率、创面炎症因子水平、创面组织学观察及相关蛋白表达。结果与结论:①联合组造模后第7,14天的创面愈合率大于空白组、单纯支架组、富血小板血浆组(P<0.05)。②联合组造模后第7,14天的肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平均低于空白组、单纯支架组、富血小板血浆组(P<0.05)。③造模后第14天的苏木精-伊红及Masson染色显示,空白组缺损处仅见少量的新生毛细血管与混乱排列的胶原纤维组织;其他3组可见大量的新生毛细血管与腺体样组织,胶原纤维排列较规律,其中以联合组新生血管最多、腺体样组织层次更清晰、胶原纤维排列更规则。免疫组化染色显示,空白组、单纯支架组、富血小板血浆组CD31+细胞密度少于联合组(P<0.05)。④Western blot检测显示,相较于空白组、单纯支架组、富血小板血浆组,联合组创面Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶抑制剂1的蛋白表达升高(P<0.05),基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9蛋白表达降低(P<0.05)。⑤结果表明,丝素胶原蛋白支架复合富血小板血浆可通过抑制炎症反应、增加微血管密度、调节细胞外基质的代谢平衡来促进皮肤创面愈合。

细胞复合型丝素支架材料修复兔桡骨骨缺损

目的比较不同孔径的细胞复合型丝素支架材料体内成骨、修复兔桡骨骨缺损的治疗效果。方法自新西兰大耳白兔股骨大结节和股骨髁处抽取骨髓，体外分离、培养、扩增兔骨髓间充质干细胞（rabbitbone marrow mesenchymal stem cells，RBMSCs），接种到3种不同孔径的丝素材料上，再移植于兔桡骨骨缺损处。根据丝素材料孔径设立实验A组[RBMSCs／SF（silk fibroin，SF）-Ⅰ]、实验B组（RBMSCs／SF-Ⅱ）、实验c组（RBMSCs／SFⅢ）。术后分别于2、4、8、12周大体观察、X线检查及组织形态学观察了解体内成骨、骨缺损修复及材料降解情况。另外设立二对照组，D组为缺损处仅植入丝素支架，E组为缺损处无植入物。结果术后各组兔子均存活，无植入物毒性反应及排斥反应，材料体积不同程度降解减小，降解速度SF-Ⅰ〈SF-Ⅱ〈SF-Ⅲ。 RBMSCs／SF-Ⅱ组比其他组在缺损种植处有更多的新骨形成，移植物的血管化在此B组也更好，缺损被较满意治愈。D、E二组修复骨缺损的效果明显差于细胞型丝素支架。结论RBMSCs／SF-Ⅱ作为细胞复合型丝素支架材料表现最佳。细胞复合型丝素支架材料有望用于临床骨缺损的治疗。

RGD序列肽修饰的丝素蛋白仿生支架材料对骨髓间充质干细胞黏附、增殖的影响

目的:为了促进种子细胞在韧带组织工程支架材料上的黏附增殖,在丝素薄膜上共价接枝人工合成的具有生物活性的GRGDS序列,并观察RGD多肽修饰的丝素蛋白支架材料对骨髓间充质干细胞的黏附、增殖的影响。方法:实验于2006-07/2007-07在华中科技大学同济医学院协和医院中心实验室和骨科实验室完成。利用市购的白色家蚕蚕丝制备丝素蛋白薄膜,在丝素蛋白支架材料表面接上海吉尔公司合成的RGD多肽,为丝素-RGD组,以未接多肽的丝素蛋白材料和细胞培养板分别作丝素组和阳性对照组。取第3代骨髓间充质干细胞接种到以上材料和培养板上培养4,12 h后,沉淀法定量检测黏附的细胞数检测细胞黏附率;培养1,2,3,4 d后比较材料上的细胞标准化细胞密度来反映细胞的增殖程度;培养24 h后对细胞骨架作免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察两组细胞骨架的组织情况。结果:培养4,12 h时丝素-RGD组细胞黏附率均显著高于丝素组(P<0.01),但与阳性对照组无明显差异(P>0.05)。培养1,2,3,4 d时各组细胞的增殖程度无显著性差异(P>0.05)。培养24 h丝素-RGD组细胞完全铺展开,有粗大的细胞骨架组织,细胞内应力纤维清晰可见,其肌动蛋白的荧光强度显著高于丝素组(P<0.05)。结论:RGD多肽修饰能显著促进骨髓基质细胞在丝素蛋白支架材料上的黏附、铺展,但对细胞增殖无明显促进作用。

人骺板软骨细胞与丝素支架的体外共培养研究

目的观察人骺板软骨细胞与丝素支架在体外进行共培养的生物相容性。方法将第一代人骺板软骨细胞与可降解的多孔丝素材料（支架）在体外进行复合、培养。用倒置显微镜、透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜和MTT等方法，观察细胞与丝素材料在体外的生物相容性。结果人骺板软骨细胞在可降解的多孔丝素材料上生长良好，随培养时间的增加而大量增多。结论人骺板软骨细胞与可降解的多孔丝素材料在体外具有良好的生物相容性，有希望作为构建组织工程骺板理想的细胞和支架。

丝素/纳米纤维素晶须/壳聚糖多孔复合支架的应用

以冷冻干燥法制备多孔丝素(SF)支架,利用层层自组装将纳米纤维素晶须(CNW)和壳聚糖(CS)交替组装到多孔SF支架上得到SF/CNW-CS多孔复合支架。对SF/CNW-CS多孔复合支架的形貌和机械性能进行了表征。以MG-63细胞进行体外培养评估SF及SF/CNW-CS多孔复合支架的细胞相容性,MTT比色法和荧光图像的测试结果表明,与SF多孔支架相比,MG-63细胞在SF/CNW-CS多孔复合支架上的增殖、粘附和分化功能最高。因此,SF/CNW-CS支架有望成为骨组织工程的理想材料。

肝素化丝素支架作为骨形态发生蛋白-2缓释载体的研究

骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的缓释载体一直是骨组织工程中的研究热点.本研究通过化学改性制备了两种肝素化丝素支架,并浸渍吸附BMP-2,研究了BMP-2在不同丝素支架样品上的吸附能力、体外释放性能及其对人骨肉瘤细胞MG-63碱性磷酸酶活性(ALP)的影响.结果表明,肝素化丝素支架对BMP-2具有较强的吸附能力,并能保持其体外缓慢释放性能;MG-63细胞在肝素化支架上生长状态良好,并具有显著的增殖能力,负载BMP-2后的肝素化支架能显著促进MG-63细胞的分化.因此,肝素化丝素支架是一种较理想的BMP-2缓释载体.

甲醇、戊二醛交联剂对丝素蛋白/明胶多孔支架的性能影响

为了对比甲醇、戊二醛两种交联剂对丝素蛋白/明胶复合多孔支架的性能影响,采用冷冻干燥法等比例制备该支架,分两组分别用甲醇和戊二醛进行交联。通过观察支架的微观形貌,测量支架的孔隙率、吸水率、溶胀率,测试热稳定性及力学性能,比较经两种交联剂处理后支架结构和性能的变化。结果表明,经戊二醛交联后的支架孔隙分布更加规则、均匀,孔隙率、吸水率、溶胀率更高,力学性能更强。采用戊二醛交联丝素蛋白/明胶复合多孔支架,能够使支架性能更加优良。

负载纳米氧化锌丝素胶原蛋白支架修复皮肤创面

背景:抗感染能力对于皮肤移植物的成败具有关键作用,将抗菌材料复合于支架上得到复合材料,是目前常用的增强移植物抗感染能力的方法之一。目的:研究负载纳米氧化锌丝素胶原蛋白支架的抗感染与抗炎作用潜能,以及其对创面修复再生的作用。方法:取32只SD大鼠,在其背部建立全层皮肤缺损模型,随机分2组干预,实验组植入负载纳米氧化锌颗粒的丝素胶原蛋白支架,对照组植入丝素胶原蛋白支架。移植后1,2,4,8周,测量创面剩余面积,计算创面愈合率;移植后1,2,4周,取创面组织,进行苏木精-伊红染色与白细胞介素6特异染色,观察创面组织形态与炎症反应,同时采用实时定量PCR检测创面组织炎症因子白细胞介素6、白细胞介素1β基因表达。结果与结论:(1)创面愈合率:实验组移植后2,4,8周的创面愈合率显著高于对照组(P<0.05);(2)苏木精-伊红染色:移植后1周,对照组有明显炎症细胞浸润;实验组炎症反应较轻,创面肉芽组织生长旺盛。移植后4周,实验组创面表皮组织结构完整而致密,基本完成创面修复;对照组未见表皮覆盖,为瘢痕化修复;(3)白细胞介素6特异染色:实验组与对照组白细胞介素6阳性着色,但程度深浅不一,移植后4周,对照组白细胞介素6表达量虽明显减少,但仍呈强阳性表达;实验组白细胞介素6呈弱阳性表达;(4)炎症因子表达:实验组移植后1,2,4周的白细胞介素6、白细胞介素1β基因表达均低于对照组,但仅移植后1,2周的组间比较差异有显著性意义(P<0.05);(5)结果表明:负载纳米氧化锌颗粒的丝素胶原蛋白支架移植,能有效减轻皮肤创伤后引起的炎症反应,加速完成皮肤创面修复。

丝素蛋白/壳聚糖复合支架有良好的细胞相容性与渗透性

背景:丝素蛋白与壳聚糖为组织工程常用的支架材料,但二者单独应用均存在一定的不足,将两者混合使用可以互为改性,充分发挥优点,获取理想的复合支架材料。目的:制备丝素蛋白/壳聚糖复合支架并对其进行性能测定。方法:通过冷冻干燥方法制备丝素蛋白/壳聚糖复合支架,采用电镜扫描检测复合支架的形态结构,并进行热重分析、力学性能及细胞毒性检测。制备季铵化壳聚糖,利用核磁共振仪表征其核磁氢谱,Zeta电位仪检测其电位和粒径分布,凝胶电泳实验检测其保护DNA的情况,透射电镜观察其与DNA结合情况。结果与结论:①扫描电镜显示丝素蛋白/壳聚糖复合支架具体良好的三维孔洞结构,孔径为50-100μm;②热重分析显示当温度小于200℃时,丝素蛋白/壳聚糖复合支架的质量损失下降速度较低;当温度上升至200-500℃时,支架质量损失速度开始加快,损失量增多;在800℃时,复合支架的残余质量为38%;③丝素蛋白/壳聚糖复合支架的最大应变可以达到94.94%,最大承受应力为7.01 MPa;④CCK-8实验显示,丝素蛋白/壳聚糖复合支架对兔骨髓间充质干细胞没有细胞毒性,具有良好的细胞相容性;⑤核磁氢谱检测显示,季铵化壳聚糖的季铵化程度约为20%;⑥季铵化壳聚糖的粒径分布为(588.56±52.39)nm,季铵化壳聚糖颗粒的表面带正电荷,电位为(16.3±3.92)mV,有利于与DNA结合;⑦凝胶电泳实验显示,季铵化壳聚糖材料的比例越高,对DNA的包裹越好,当其与DNA的比例为1∶3时,对DNA达到包裹作用;⑧透射电镜显示,季铵化壳聚糖/DNA大部分的微粒呈实心圆形,微粒粒径差别较小,平均粒径约为200 nm;⑨结果表明,丝素蛋白/壳聚糖复合支架有良好的细胞相容性与细胞渗透性,利于细胞在支架间的生长。

丝素蛋白三维支架与骨髓间充质干细胞的生物相容性观察

目的制备丝素蛋白三维支架,并与大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）复合培养,观察二者的生物相容性。方法将家用蚕丝反复脱胶,计算脱胶率;将脱胶的蚕丝溶于Li Br溶液中获得丝素蛋白溶液,置于真空冷冻干燥机中作用24 h,获得成型的丝素蛋白三维支架。液体置换法计算支架孔隙率;将该支架与MSCs复合培养,记录支架降解1~8周降解液的p H值变化,MTT法检测支架的细胞毒性（以吸光度值表示）,扫描电镜下观察支架结构及MSCs生长情况。结果平均脱胶率为20.72%,平均支架孔隙率为65.25%。复合培养1~8周降解液p H值分别为6.98、6.93、6.90、6.83、6.72、6.75、6.78、6.76。两组吸光度值比较,P均〉0.05。扫描电镜下观察到该支架具有三维空间结构,孔隙大小分布较均匀;复合物中可见MSCs在支架上生长良好,部分细胞嵌入支架孔隙中,与支架黏附良好;细胞外基质分泌量多,细胞与细胞间、细胞与支架间通过细胞外基质紧密相连。结论成功制备丝素蛋白三维支架,该支架对MSCs无毒性作用,具有良好的生物相容性,是一种理想的韧带组织工程学支架材料。

丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架材料的表征及细胞相容性

背景：丝素蛋白和透明质酸具备细胞外基质两种主要成分特征,并且有良好的生物相容性.目的：采用冷冻干燥法制备丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架,并观察其表征与细胞生物相容性.方法：将丝素蛋白与透明质酸按10∶1 混合通过冷冻干燥法构建丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架并观察其表征.将1×108 L-1的第3～5 代大鼠骨髓间充质干细胞接种在丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架上观察其细胞生物相容性.结果与结论：采用冷冻干燥法可以成功制备丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架,与纯丝素蛋白支架相比,复合支架具有更好的多孔三维结构.此外,支架制备过程中不含有毒溶剂,支持骨髓间充质干细胞的黏附铺展与增殖.说明实验制备的丝素蛋白/透明质酸复合支架的成孔性好,具有良好的细胞生物相容性.

脂肪干细胞-丝素/壳聚糖支架复合物在外泌体诱导下的体外成骨效应

目的探究成骨分化脂肪干细胞(ADSCs)来源的外泌体对ADSCs-丝素/壳聚糖三维支架复合物(ADSCs-SF/CS)的成骨效应。方法体外提取、培养和鉴定ADSCs,采用冷冻干燥法制备三维支架。将ADSCs诱导为成骨细胞,超速离心提取外泌体。将ADSCs接种于支架上,扫描电镜观察。将细胞支架复合体分为普通培养液组(阴性对照组)、成骨诱导液组(阳性对照组)、普通培养液加外泌体组(实验组a)、成骨诱导液加外泌体组(实验组b),连续培养14 d后,采用Western blotting检测成骨相关蛋白Runx2的表达量以证实ADSCs成骨分化,并通过CCK-8法及碱性磷酸酶(ALP)活性检测探究外泌体对ADSCs-SF/CS复合物中ADSCs体外增殖及成骨分化效应的作用。结果CCK-8结果显示,实验组a与阴性对照组相比,加入外泌体有利于ADSCs的增殖,Runx2及ALP活性结果显示,实验组b与阳性对照组相比,加入外泌体可使ADSCs-SF/CS复合物中的ADSCs成骨效应显著增强。结论成骨诱导后,ADSCs来源的外泌体可诱导附着于SF/CS上的ADSCs向成骨细胞分化,并且对ADSCs的成骨具有促进效应。

慢病毒介导BMP-2过表达质粒转染骨髓间充质干细胞联合丝素蛋白支架向成骨细胞转化的实验研究

目的:探究慢病毒介导BMP-2过表达质粒转染骨髓间充质干细胞联合丝素蛋白支架向成骨细胞转化的作用效果。方法:构建慢病毒BMP-2过表达载体,培养骨髓间充质干细胞,构建细胞核支架的联合培养体系,体外实验利用茜素红染色和碱性磷酸酶染色检测骨髓间充质干细胞的成骨转化。选择10只新西兰大白兔,体重3.2~4.5 kg,平均3.9 kg;年龄(2.89±0.45)岁;使用口腔钻在兔子胫骨钻孔(长度5 mm、宽度2 mm、深度3 mm的锥形胫骨缺损)构建兔子胫骨骨缺损模型,HE染色观察动物模型内骨缺损的修复。实验组造模后植入丝素蛋白支架+转染BMP-2过表达载体骨髓间充质干细胞复合物,阴性对照组造模后植入丝素蛋白支架+未转染骨髓间充质干细胞复合物。结果:实验组(丝素蛋白支架+转染BMP-2过表达载体骨髓间充质干细胞复合物)中支架表面黏附的细胞与对照组(丝素蛋白支架+未转染骨髓间充质干细胞)相比,细胞数明显增多。实验组细胞外基质分泌与对照组相比,支架间细胞外基质含量明显增多。对照组支架表面元素EDX分析显示钙离子含量为0.22%,实验组支架表面元素EDX分析显示钙离子含量为0.86%,可见实验组诱导钙离子形成的能力要比对照组强。钙结节茜素红染色结果显示,对照组肉眼观无明显变化,镜下观察可见少量钙结节点。实验组肉眼观可见明显红色区域染色,镜下观察可见大量钙结节点。碱性磷酸酶染色结果显示,对照组肉眼观无明显变化,镜下观察未见明显变化。实验组肉眼观可见紫色区域染色,镜下观察可见ALP染色呈强阳性。丝素蛋白支架与骨髓间充质干细胞联合培养体系可以对软骨缺损有较好的修复作用,转染BMP-2骨髓间充质干细胞后修复作用明显优于未转染组。HE染色结果显示,对照组炎性细胞减少,支架略有消失。实验组炎性细胞明显减少,支架消失,血管生成。结论:慢病毒介导BMP-2过表达质粒可以促进BMSC向骨细胞的分化作用,并且分泌更多的含Ca2+成分的细胞外基质,从而发挥其促进骨缺损修复的作用。

外泌体联合丝素蛋白支架对软骨缺损的修复作用

目的探讨多聚蛋白多糖(Aggrecan)过表达载体修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源外泌体联合丝素蛋白支架对新西兰大白兔软骨缺损的修复作用。方法培养兔源性BMSCs,流式细胞仪检测第2代BMSCs表面蛋白CD44、CD29、CD34和CD45表达。慢病毒Aggrecan过表达质粒转染BMSCs,超速离心法提取外泌体,Western Blot方法检测外泌体分子标志物CD81和CD63的表达。构建丝素蛋白支架联合外泌体复合物,利用扫描电镜技术检测丝蛋白支架的结构。利用苏木精-伊红(HE)染色和番红-快绿染色检测新西兰大白兔软骨缺损模型中软骨结构。结果第2代BMSCs表面蛋白CD44和CD29表达分别为60.2%和58.3%,CD34和CD45表达分别为3.4%和2.6%。慢病毒Aggrecan过表达载体转染效率为(95±2)%。扫描电镜观察显示,外泌体为直径40～100nm双层膜的膜状结构。Western Blot检测显示,外泌体可以表达分子标志物CD81和CD63。HE染色和番红-快绿染色结果显示,Aggrecan过表达载体修饰BMSCs分泌的外泌体联合丝素蛋白支架对软骨缺损的修复作用明显优于BMSC组和阴性对照组(F=19.298、12.548,P<0.05)。结论 Aggrecan过表达载体修饰BMSCs分泌的外泌体联合丝素蛋白支架对软骨缺损的修复具有明显的促进作用,可为骨性关节炎治疗提供新的思路与方法。

丝素-壳聚糖支架对骨髓间充质干细胞黏附、增殖和成骨分化的影响

目的评价丝素-壳聚糖(SF-CS)支架对骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附、增殖和成骨分化的影响。方法采用冷冻干燥法制备SF-CS支架并进行物理性能表征。将BMSCs接种到SF-CS支架上作为实验组,以直接接种于培养皿中的BMSCs作为对照组。通过扫描电镜观察细胞在支架上的黏附情况;采用CCK-8法检测BMSCs的细胞增殖;采用荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测BMSCs成骨分化相关基因的表达水平。结果BMSCs沿SF-CS支架三维多孔结构黏附。实验组细胞增殖及成骨分化相关基因的表达水平均高于对照组,差别具有统计学意义(P<0.05)。结论SF-CS支架影响BMSCs的黏附形态,促进BMSCs的增殖和成骨分化。

复合骨碎补总黄酮的丝素蛋白/壳聚糖支架在兔关节软骨损伤中的应用研究

目的以丝素蛋白/壳聚糖支架为载体将骨碎补总黄酮应用于兔软骨损伤局部,观察修复效果,为临床提供实验数据。方法制备丝素蛋白/壳聚糖支架、骨碎补总黄酮缓释微球与负载骨碎补总黄酮缓释微球的丝素蛋白/壳聚糖支架,扫描电子显微镜下观察支架形貌,同时检测该支架的体外缓释能力。24只新西兰大白兔随机分3组,利用电钻在股骨滑车部位构建直径3.5 mm、深1.5 mm的软骨损伤模型,空白组软骨缺损处不植入任何材料,对照组植入单纯的丝素蛋白/壳聚糖支架,实验组植入负载骨碎补总黄酮缓释微球的丝素蛋白/壳聚糖支架,术后12周、24周行标本大体与组织学观察,RT-PCR检测修复组织Sox-9、II型胶原与聚集蛋白聚糖mRNA的表达量,Western blot检测软骨缺损部位II型胶原蛋白表达,分析软骨修复效果。结果丝素蛋白/壳聚糖支架具有良好的三维孔隙结构,孔洞之间相互联通;制备的载药微球表面较光滑,为较规则的圆球形;载药微球均匀分散于丝素蛋白/壳聚糖支架基质中。丝素蛋白/壳聚糖支架可在体外持续稳定地释放骨碎补总黄酮,实验组软骨损伤修复效果优于对照组,对应的ICRS评分与Wakitani组织学评分高于对照组(P<0.05)。实验组的软骨基因Sox-9、Ⅱ型胶原与聚集蛋白聚糖mRNA的表达量高于对照组(P<0.05),Ⅱ型胶原蛋白的表达高于对照组(P<0.05)。结论负载骨碎补总黄酮的丝素蛋白/壳聚糖支架植入软骨损伤部位可持续缓慢地释放骨碎补总黄酮,为种子细胞的生长与分化提供适合的微环境,有效促进软骨组织再生。