类蚕丝丝素结晶区蛋白表达载体的构建与表达

为探讨蚕丝结构与性能的关系,设计了几种类似蚕丝丝素结晶区高度重复序列结构(GAGAGX)n的基因序列,并构建了大肠杆菌表达载体,在BL-21菌株中成功诱导表达了4种约由110个氨基酸组成的小分子蛋白。对表达产物进行W estern印迹分析和ELISA检测的结果显示,(GAGAGA)n、(GAGAGY)n、(GAGAGV)n3种蛋白都有小于14.4 kD的大小相同的条带,而(GAGAGS)n有一条稍大于20.1 kD的条带。以超声波破菌的缓冲液作空白对照,4种蛋白的ELISA的结果均比对照的BL-21(无质粒)高,显示为阳性。

Thioflavine T荧光探针法研究丝素结晶区典型肽段自聚集的β-片层结构

为了深入研究蚕丝丝素基材料的自组织/自组装机制,设计了四种结构单纯的蚕丝结晶区肽段:GXGAGAGXGA(X:A,S,Y,V),保温培养1～15d,使之自聚集.采用ThT荧光光谱法和尿素抑制处理研究了它们形成β-片层结构的能力.结果显示:肽段GA在溶液中保温聚集1d就明显有β-片层结构生成,按A,S,Y,V的顺序分别保温12,8,14,13d,聚集体中β-片层结构比例趋于稳定,其中形成β-片层结构比例最高的是GS,其次是GA,GY和GV较少.肽段溶液中尿素的存在对β-片层的形成影响十分显著,尿素浓度为1mol/L时足以使GS,GY和GV自聚集时无法形成β-片层结构;大于2mol/L时开始影响GA的β-片层形成,随着尿素浓度的增加β-片层结构的比例随之下降.

家蚕丝素结晶区高度重复多肽[GAGAGA]_(16)和[GAGAGS]_(16)的融合蛋白优化表达

为了给深入研究家蚕丝素结晶区的典型肽段结构提供素材,对设计的GST-tag家蚕丝素结晶区典型多肽[GAGAGA]16和[GAGAGS]16的融合蛋白KGA、KGS进行了表达条件优化试验。结果表明,pGEX-KGA和pGEX-KGS表达载体能够有效表达家蚕丝素结晶区的2种典型多肽,KGA和KGS的最佳表达诱导剂IPTG的浓度分别为1.4mmol/L、1.0 mmol/L,诱导时间为5 h。在此优化条件下,KGA和KGS在大肠杆菌（E.coli）中的表达量分别达75 mg/L、110 mg/L。诱导起始时大肠杆菌的菌密度（OD600为0.4-3.0）对2种融合蛋白的表达效率没有显著影响。

家蚕丝素结晶区典型多肽[GAGAGY]16和[GAGAGV]16的融合蛋白优化表达

家蚕丝素结晶区典型多肽[GAGAGY]16、[GAGAGV]16的GST融合蛋白KGY和KGV是深入研究家蚕丝素结晶区典型多肽聚集态结构的素材。对这2种融合蛋白在大肠杆菌中的表达条件进行优化试验的结果表明,表达载体pGEX-KGY和pGEX-KGV能够有效表达家蚕丝素结晶区的这2种典型多肽。KGY和KGV的最佳诱导表达条件:IPTG浓度分别为0.2 mmol/L和1.0 mmol/L,诱导时间分别为5 h和4 h。在此条件下,2种融合蛋白在大肠杆菌中的表达量分别达115 mg/L和90 mg/L左右。诱导起始时大肠杆菌的菌密度(OD600为0.4～3.0)对2种融合蛋白的表达效率没有显著影响。