丝素蛋白-左旋聚乳酸微载体扩增脂肪来源干细胞的实验研究

目的探讨丝素蛋白-左旋聚乳酸(silk fibroin-poly-L-lactic acid,SF-PLLA)微载体对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的扩增作用及对其分化能力的影响。方法使用脂肪抽吸术患者自愿捐赠脂肪组织,经酶消化法提取ADSCs。取第3代ADSCs分别接种于CultiSpher G和SF-PLLA微载体(分别设为A、B组),细胞-微载体复合物应用旋转生物反应器培养,并采用正常二维平面传代培养的ADSCs作为对照组(C组)。应用扫描电镜观察两种微载体结构及细胞生长状况;Live/Dead染色观察细胞在两种微载体上分布及成活情况;DNA定量法检测两种微载体上细胞增殖情况;培养18 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测3组ADSCs成软骨、成骨、成脂相关基因表达,行流式细胞术鉴定MSCs表面标志物,并行成软骨、成骨、成脂三系分化鉴定。结果 ADSCs在两种微载体上均可黏附并实现高效扩增,扩增18 d时两种微载体上ADSCs总扩增量差异无统计学意义(P>0.05)。对扩增所得ADSCs行qRT-PCR检测示,与C组比较,B组成软骨相关基因(蛋白聚糖、软骨寡聚基质蛋白、软骨特异性基因SOX9)呈显著上调,A组成脂相关基因(过氧化物酶体增殖物激活受体γ、脂蛋白酯酶、脂联素基因)呈显著上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测与三系分化鉴定显示两种微载体扩增后细胞仍为ADSCs,仍具有三系分化能力。结论 SF-PLLA微载体可用于扩增ADSCs,且扩增所得细胞成软骨分化趋势显著提高,成脂分化趋势降低。

丝素蛋白／左旋聚乳酸复合组织工程纳米材料的生物相容性及安全性评价

目的:研究新型组织工程纳米材料丝素蛋白/左旋聚乳酸(SF/PLLA)无纺网的生物相容性和安全性,探讨其作为生物植入材料的可行性。方法:采用静电纺丝方法制备SF/PLLA复合组织工程纳米材料,制备浸提液,并以生理盐水作为对照,注射入小鼠体内,观察2周内小鼠的一般情况和不良反应;将材料植入小鼠背部,以3-0缝线作为对照,于术后1、2、3和4周分别取材,HE染色并拍照,比较实验组与对照组周围组织的炎症反应情况;培养兔膝关节软骨细胞,传代后接种至材料表面,在体外继续培养,倒置光学显微镜观察细胞的黏附和生长情况。将关节软骨细胞分为阴性对照组(空白培养液)、实验组(含材料的培养液)和阳性对照组(含苯酚培养液),不同组材料浸提液与细胞共培养24和48h,MTT法检测材料对软骨细胞增殖的影响。结果:注射浸提液后小鼠的全身状况与注射生理盐水后无差别;材料植入小鼠背部后,开始有少量成纤维细胞长入材料中,伴随出现少量的淋巴细胞及异物巨细胞,随后成纤维细胞数量增加,淋巴细胞及异物巨细胞无明显增多,材料慢慢降解,直至第4周时材料出现明显的降解;材料周围组织炎症反应,第2周时最严重,然后逐渐减轻,其周围组织炎症反应与缝线周围组织一致或略轻;将细胞接种于支架上24h后有细胞贴附于材料纤维上,48h后贴附于纤维上的细胞数量增多。MTT法检测,实验组24和48h细胞毒性均为Ⅰ级。除阳性对照组外,其他各组随着培养时间的延长,吸光度(A)值均增加;同一时间点,实验组与阴性对照组A值比较差异无统计学意义(P>0.05),与阳性对照组比较A值明显升高(P<0.01)。结论:SF/PLLA无纺网支架材料属于安全植入性材料,具有良好的生物相容性。

丝素蛋白/左旋聚乳酸支架材料与软骨细胞体外细胞相容性研究

目的:观察静电纺丝支架材料丝素蛋白/左旋聚乳酸(SF/PLLA)的体外细胞相容性,探索其作为软骨组织工程支架材料的可行性,为进一步的体内及动物实验奠定基础。方法:将兔膝关节软骨细胞与丝素蛋白/左旋聚乳酸(SF/PLLA)支架材料复合培养,在第3、7、14天分别作HE染色和阿利新蓝+核固红染色,扫描电镜检验细胞黏着情况,MTT试验检测细胞在支架上的增殖情况。结果:细胞在支架上可以获得良好的粘附,细胞增殖良好,无细胞表型的变化。结论:丝素蛋白/左旋聚乳酸(SF/PLLA)具有良好的细胞相容性,可作为软骨组织工程支架材料。

丝素改性聚乳酸-羟基乙酸共聚物多孔微球作为牙龈间充质干细胞递送载体的研究

利用复乳-溶剂挥发法合成适合细胞三维培养的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)多孔微球,并对其表面进行丝素改性,利用扫描电子显微镜、能谱、红外光谱和X射线衍射等对改性前后PLGA多孔微球的理化特性进行表征.原代培养人牙龈间充质干细胞并进行成骨(茜素红染色)成脂(油红O染色)分化鉴定.通过负压混悬法将牙龈干细胞负载于丝素改性的PLGA多孔微球上进行5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)细胞增殖及成骨分化研究.结果表明,原代培养的牙龈干细胞具有多向分化潜能,负载在丝素改性的PLGA多孔微球上的细胞有利于细胞增殖.丝素改性的PLGA多孔微球是良好的细胞递送载体,为进一步修复牙槽骨缺损提供了科学依据.

丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯纳米纤维支架对兔腱-骨愈合影响的实验研究

目的探讨丝素蛋白(silk fibroin,SF)/聚乳酸-聚己内酯[poly(L-lactic acid-co-e-caprolactone),P(LLA-CL)]纳米纤维支架对兔腱-骨愈合的影响。方法通过静电纺丝技术制备SF/P(LLA-CL)纳米纤维支架,扫描电镜观察材料形貌;并将支架与小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1复合培养1、3、5 d,扫描电镜观察细胞黏附、增殖情况。取24只新西兰大白兔随机分为两组(n=12),对照组采用自体肌腱、实验组采用SF/P(LLACL)纤维纳米支架包裹自体肌腱建立关节外模型;术后6、12周采用组织学和生物力学测试评价腱-骨愈合情况。结果 SF/P(LLA-CL)纳米纤维支架为非取向结构,纤维直径为(219.4±66.5)nm;复合培养后,MC3T3-E1细胞在支架上生长良好,并随时间延长细胞逐渐增多。组织学观察示,术后6周两组腱-骨界面均有炎性细胞浸润,界面宽度未见明显差异;12周时实验组腱-骨界面可见新骨长入,而对照组无新骨长入。生物力学测试,术后6周,两组失效负荷及刚度比较差异均无统计学意义(P>0.05);12周时实验组失效负荷及刚度均显著高于对照组(P<0.05)。结论 SF/P(LLA-CL)纳米纤维支架具有较好的细胞相容性,能有效促进兔腱-骨愈合,为临床上ACL重建移植物的改良提供新思路。

组织工程技术复合修复兔口腔黏膜的实验研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMMSCs)与左旋聚乳酸/丝素蛋白(PLLA/SF)支架复合物修复兔口腔黏膜的可行性,同时评估PLLA与SF以何种比例混合构建组织工程口腔黏膜支架最理想。方法:分离、培养并鉴定BMMSCs,将其置于PLLA与SF的质量配比为70∶30(P70S30)PLLA/SF支架上复合培养1周后观察细胞表型有无改变;观察BMMSCs与P70S30的PLLA/SF支架复合物的口腔黏膜移植1周后的结构变化;比较细胞与支架复合物组、单纯支架组、创面自然修复组的创面愈合率。结果:1PLLA/SF支架对BMMSCs的细胞表型无明显影响;2BMMSCs与P70S30的PLLA/SF支架复合物口腔黏膜移植1周后与创面的融合较好;3以PLLA与SF的质量配比为70∶30的复合物组愈合率最高,平均愈合率为94.8%,与创面自然修复组及单纯支架组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:1BMMSCs与PLLA/SF支架复合物具有构建理想的组织工程口腔黏膜的潜力;2PLLA与SF的质量配比为70∶30时最利于口腔黏膜创面的愈合,构建理想的组织工程口腔黏膜的潜力最大。