针刺对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠磷酸化P38丝裂原活化蛋白酶和血清白介素1β的影响

目的观察针刺对实验性自身免疫性脑脊髓炎(encephalomyelitis,EAE)小鼠神经系统损伤症状的改善程度和脊髓磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated P38 mitogen-activated protease,p-p38MAPK)及血清IL-1β的影响,初步探究针刺对多发性硬化(multiple sclerosis,MS)实验动物模型-EAE小鼠的治疗作用和机制。方法将40只C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、模型+针刺组(针刺组)、模型+激素组(激素组),每组10只。除空白组外,其余各组小鼠采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白33-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein 33-55,MOG 33-55 )与完全弗氏佐剂诱导建立EAE模型。各组自造模第14天开始,每日上午同一时间干预治疗。空白组和模型组每日抓取、固定,并用生理盐水[0.1 mL/(10 g·d)]灌胃;针刺组针刺小鼠“大椎”、双侧“足三里”“肾俞”穴15分钟;激素组用醋酸泼尼松龙(0.6 mg/mL)灌胃[0.1 mL/(10 g·d)]治疗;以上各组均连续干预治疗15天。从造模当天开始,隔日测量体质量和神经功能评分评价小鼠行为学变化;于免疫第28天对各组小鼠进行眼球采血并留取脊髓组织,采用LFB染色技术检测小鼠脊髓脱髓鞘损伤程度;分别采用酶联免疫吸附法和蛋白质免疫印迹法检测小鼠血清IL-1β的含量及脊髓组织p-p38MAPK蛋白表达。结果针刺组和激素组小鼠体质量明显增加,神经功能评分明显降低,与模型组比较差异有统计学意义( P <0.05);与模型组相比,针刺组及激素组小鼠脊髓脱髓鞘程度明显减轻;免疫第28天时,模型组小鼠血清IL-1β表达与空白组相比水平升高( P <0.05);针刺组与激素组小鼠血清IL-1β水平与模型组相比均降低( P <0.05);模型组小鼠脊髓p-p38MAPK蛋白表达水平比空白组表达水平升高( P <0.05);而针刺组与激素组小鼠脊髓p-p38MAPK蛋白水平与模型组相比均降低( P <0.05)。结论针刺可以明显改善EAE小鼠神经系统损伤症状,降低EAE小鼠的神经功能评分;针刺缓解EAE模型小鼠神经系统损伤症状的机制可能与其能抑制EAE小鼠脊髓p38MAPK蛋白激活及其能降低小鼠血清IL-1β的表达水平有关。

针刺对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠磷酸化P38丝裂原活化蛋白酶的影响

目的观察针刺对自身免疫性脑脊髓炎小鼠(EAE)的疗效及其对脑干磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)的影响,探究针刺对EAE小鼠的治疗作用和机制,为临床治疗MS提供新的思路方法。方法将40只C57BL/6小鼠随机分成4组。空白组小鼠不作处理,其余组采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)制备的完全抗原将小鼠诱导成EAE模型。造模后第14天开始,空白组及模型组每日固定,并用生理盐水灌胃。激素组每日与醋酸泼尼松灌胃。针刺组小鼠针刺"大椎"、双侧"肾俞""足三里"。记录小鼠体重和神经功能评分。免疫第28天后对脑组织进行取材,用LFB染色观察病理变化,检测脑组织中p-p38MAPK免疫组化表达及p-p38MAPK的WB表达。结果与空白组相比,其余各组小鼠体重降低(P<0.05),神经功能评分升高(P<0.05),LFB染色脱髓鞘程度升高,p-p38MAPK免疫组化及WB检测均升高(P<0.05)。与模型组相比,针刺组及激素组体重升高(P<0.05),神经功能评分降低(P<0.05),LFB染色脱髓鞘程度降低,p-p38MAPK免疫组化及WB检测均降低(P<0.05)。与激素组相比,针刺组体重降低(P<0.05),神经功能评分升高(P<0.05),p-p38MAPK免疫组化及WB检测升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论针刺可能是通过降低EAE小鼠p-p38MAPK表达,降低EAE小鼠炎症反应,减轻神经损伤从而发挥治疗作用。

p38丝裂原活化蛋白激酶与骨代谢

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)是机体广泛表达的丝氨酸/酪氨酸激酶,在哺乳动物细胞多种信号转导通路中起重要作用。p38MAPK信号通路是MAPK通路的一个重要分支,在细胞增殖、分化、凋亡和细胞周期调控等多种生理和病理过程中发挥重要作用。近年来,有关p38MAPK信号通路在与骨代谢相关的破骨细胞、成骨细胞、软骨细胞生长、代谢及功能方面的研究倍受关注。本文就p38MAPK与骨代谢相关研究进展进行综述,旨在探讨p38MAPK在骨代谢相关疾病中的作用机制。

丝裂原活化蛋白激酶信号途径在热休克蛋白90基因表达中的作用

目的 研究丝裂原活化蛋白激酶 - (MAPK)信号传导途径对 Jurkat细胞中热休克蛋白 90基因(hsp90 )表达的影响。方法 用 Western免疫印迹 -增强型化学发光系统 (ECL)检测热休克前后 Jurkat细胞胞外信号调节激酶 (ERK)、p38激酶及 c- Jun N-末端蛋白激酶 (JNK)的底物 c- Jun的磷酸化程度 ;分别用 JNK1的显性负突变质粒 DN- JNK1、p38c DNA反义表达质粒 anti- p38及 ERK激酶的特异性抑制剂 PD980 5 9瞬时转染或处理Jurkat细胞 ,再行 RT- PCR检测 hsp90 α和 hsp90 β基因的表达水平。分别以转染空载体 (p CDNA3)及未经任何处理的 Jurkat细胞作为相应对照组。结果 45℃热休克 15 min后 ,Jurkat细胞中 JNK1和 p38激酶的磷酸化程度与热休克前相比明显增强 ,ERK的磷酸化较热休克前有所增强。转染 DN- JNK1的细胞中 hsp90 α和 hsp90 β基因的组成性和热诱导表达均较转染空载体的对照组降低 ,尤其对 hsp90 α基因的热诱导表达的影响更为明显 (仅为对照组的6 8% ) ;转染 anti- p38后 ,hsp90 α基因的组成性表达和 hsp90 β基因热诱导表达分别比转染空载体的对照组增加2 6 %和 2 2 % ;经 PD980 5 9处理的 Jurkat细胞中 ,hsp90 α基因的组成性表达比未处理的细胞增加 46 % ,但 PD980 5 9处理对 hsp90 α和

丹连消痤散外用对痤疮模型兔耳NF-κB p38MAPK蛋白表达的影响

目的:观察丹连消痤散外用对痤疮模型兔耳NF-κB(核转录因子kappa B)、p38MAPK(p38丝裂原活化蛋白酶)水平的影响。方法:将12周龄雄性新西兰大白兔48只,随机数字表法将其分为6组:丹连消痤散高剂组、中剂组、低剂组、阳性对照组(克痤隐酮凝胶)、模型对照组、正常对照组,每组8只。除正常组外,其余各组Kligman法制备兔耳痤疮模型,并分别皮肤给药,每日1次,连续14 d。免疫组化法检测兔耳NF-κB、p38MAPK蛋白表达。结果:模型组兔耳NF-κB、p38MAPK蛋白表达较正常组明显增强(P <0. 01),与模型组比较,阳性对照组、高剂组、中剂组、低剂组兔耳NF-κB、蛋白表达明显减弱(P <0. 05)。正常组、模型组与各组间均有显著差异,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论:丹连消痤散能够明显抑制痤疮模型兔耳NF-κB、p38MAPK表达,减轻炎症反应。

基于MAPK信号通路探讨双醋瑞因对IL-1β诱导软骨细胞退变的干预作用

目的基于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,从细胞分子水平探讨双醋瑞因对膝骨性关节炎(osteoarthritis,OA)的抗炎机制。方法选取2~3月龄新西兰兔5只,提取并培养软骨细胞至第2代软骨细胞,使用白细胞介素1β(interleukin 1 beta,IL-1β)进行干预后获得退变软骨细胞模型。将分离培养的软骨细胞分为空白对照组、IL-1β组、双氯芬酸钠组和双醋瑞因低浓度组、双醋瑞因中浓度组、双醋瑞因高浓度组。空白对照组不进行任何干预,其他组选用IL-1β诱导的退变软骨细胞模型。双氯芬酸钠组采用1.6 mg/L双氯芬酸钠处理退变软骨细胞;双醋瑞因低、中、高浓度组分别采用0.1、1、10 mol/L的双醋瑞因处理退变软骨细胞。采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组细胞上清液基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)、IL-17、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)浓度,分别采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和Western blot检测各组细胞中p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p65、MMP-13 mRNA及蛋白表达水平。结果ELISA结果显示,与空白对照组相比,IL-1β组细胞上清液中MMP-13、IL-17、TNF-α浓度显著升高(P均<0.05);与IL-1β组相比,双氯芬酸钠组和双醋瑞因低、中、高浓度组细胞上清液中MMP-13、IL-17、TNF-α浓度显著降低(P均<0.05);与双氯芬酸钠组相比,双醋瑞因高浓度组MMP-13、IL-17、TNF-α浓度明显降低(P均<0.05);与双醋瑞因低浓度组相比,双醋瑞因高浓度组细胞上清液中MMP-13、IL-17、TNF-α浓度显著降低(P均<0.05)。RT-qPCR、Western blot结果显示,与空白对照组相比,IL-1β组p38、JNK、ERK、p65、MMP-13 mRNA表达和蛋白水平显著升高(P<0.05);与IL-1β组相比,双氯芬酸钠组和双醋瑞因低、中、高浓度组p38、JNK、ERK、p65、MMP-13 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P均<0.05);与双氯芬酸钠组相比,双醋瑞因高浓度组p38、JNK、ERK、p65、MMP-13 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P均<0.05);与双醋瑞因低浓度相比,双醋瑞因高浓度组p38、JNK、ERK、p65、MMP-13 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P均<0.05)。结论MAPK信号通路在IL-1β诱导的新西兰兔退变软骨细胞中过表达。双醋瑞因可以通过调控MAPK信号通路,起到保护IL-1β诱导的新西兰兔退变软骨细胞的作用。

ERK1/2,JNK和P38MAPK在皮肤黑素瘤中的表达

目的检测ERK1/2,JNK和P38MAPK在皮肤黑素瘤中的表达情况,初步探讨它们与黑素瘤发生、发展的关系。方法分别采用免疫组化和Western印迹法检测磷酸化的ERK1/2,JNK及P38MAPK在皮肤黑素瘤、皮内痣组织中的表达情况;用实时荧光定量聚合酶链反应(Real time-PCR)方法定量分析皮内痣和皮肤黑素瘤中ERK1/2,JNK和P38MAPK mRNA的表达情况。结果免疫组化和Western印迹法结果均显示p-ERK1/2,p-JNK及p-P38MAPK在皮肤黑素瘤中的表达高于皮内痣组(P<0.05);Western印迹法显示p-ERK1/2,p-JNK及p-P38MAPK在皮内痣组中的表达高于正常对照组(P<0.05)。ERK1/2,JNK及P38MAPK mRNA在皮肤黑素瘤和皮内痣中的表达均高于正常皮肤组织(P<0.05);皮肤黑素瘤中ERK1/2,P38MAPKmRNA的表达均高于皮内痣(P<0.05);而皮肤黑素瘤中JNK mRNA的表达与皮内痣组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ERK1/2,JNK和P38MAPK在皮肤黑素瘤表达增高,提示MAPK信号通路在皮肤黑素瘤发生、发展中起到重要作用,该信号通路有望成为预防和治疗皮肤黑素瘤的新靶点。

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶介导血管紧张素Ⅱ诱导的肾小球系膜细胞增殖

目的:探讨活性氧(ROS)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的c-Jun氨基末端激酶(JNK)/活化蛋白(AP-1)信号通路活化及系膜细胞增殖中的作用并探讨其来源。方法:体外培养人肾小球系膜细胞,应用3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入法和细胞计数测定系膜细胞增殖;荧光探针2,7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸(DCFDA)检测细胞内ROS的产生;化学发光法检测尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性;WesternBlot检测JNK活化。结果:AngⅡ呈时间依赖性和剂量依赖性促进肾小球系膜细胞ROS产生。AngⅡ刺激3min,系膜细胞内ROS产生明显增加,至60min达到高峰。AT1R血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT1R)拮抗剂氯沙坦完全阻断了AngⅡ诱导的ROS产生。NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素和二联苯碘(DPI)几乎完全阻断AngⅡ诱导的ROS产生,而线粒体复合体Ⅰ抑制剂鱼藤酮、黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇、环氧化酶抑制剂吲哚美辛、脂氧化酶抑制剂去甲二氢化愈创木酸、细胞色素P450氧化酶抑制剂酮康唑以及一氧化氮合成酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对AngⅡ诱导的ROS产生均无明显影响。AngⅡ显著刺激NADPH氧化酶活化及p47phox和p67phox膜转位。氯沙坦、乙酰半胱氨酸(NAC)、夹竹桃麻素和DPI阻断AngⅡ诱导的JNK/AP-1活化和系膜细胞增殖。结论:NADPH氧化酶来源的ROS调控AngⅡ诱导的JNK/AP-1信号通路活化及系膜细胞增殖。NADPH氧化酶抑制剂能显著抑制AngⅡ诱导的系膜细胞增殖,可能具有一定的治疗作用。

尼莫地平注射液抑制ERK1/2和P38 MAPK的磷酸化对人星形胶质瘤细胞U-251 MG生长和运动的抑制作用

目的采用体外培养人星形胶质瘤U-251MG细胞为研究对象,探讨尼莫地平注射液(Nimodip-ine,Nim)对其生长和运动的影响及其机制.方法CCK8法检测不同浓度Nim处理U-251MG后细胞存活率,选择无明显毒性的3个剂量进行后续实验.将细胞随机分为对照组、Nimodipine 0.125 mg组、Nimodip-ine 0.25 mg组和Nimodipine 0.5 mg组,采用Edu染色检测细胞增殖;Hoechst检测细胞凋亡情况;Transwell检测细胞侵袭;划痕实验检测细胞迁移;镜下观察细胞形态变化;Western印迹检测增殖相关蛋白Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA),凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、caspase-9,上皮间质转换(EMT)相关蛋白上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、神经钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达水平及信号通路细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、P38丝裂原活化蛋白酶(P38MAPK)的磷酸化水平.结果当Nim浓度达到1 mg/L时,可以对U-251MG细胞产生明显的细胞毒性,故选择无明显细胞毒作用的0.125、0.25和0.5 mg/L 3个剂量进行后续试验.Nim能剂量依赖性的抑制体外培养U-251MG细胞的增殖、侵袭和迁移能力,增加细胞凋亡率;促进E-cadherin,抑制caspase-3、caspase-9、Vimentin、N-cadherin、p-ERK1/2和p-P38的蛋白表达.结论Nim能有效调节人星形胶质瘤U-251MG细胞的生长和运动能力,其机制与调节ERK1/2和P38MAPK信号通路的磷酸化有关.

白杨素改善急性心肌梗死大鼠心功能的作用及对MMP-2/MAPK表达的影响

目的:探讨白杨素改善急性心肌梗死大鼠心功能的作用及对基质金属蛋白酶2(MMP-2)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)表达的影响。方法:100只SD大鼠随机分为5组:正常对照组、模型组、阳性对照组(培哚普利,0.4 mg·kg^-1)、白杨素低、高剂量组(20,40 mg·kg^-1),每组20只。除正常对照组外,其余各组建立急性心肌梗死模型,阳性对照组、白杨素低、高剂量组于建模成功后给予相应药物灌胃,正常对照组和模型组给予等体积生理盐水,qd,连续给药2周。实验结束后,观察心肌病理结构变化,测定常规心功能指标和心肌酶指标,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法及蛋白免疫印迹(Western blot)法测定心肌MMP-2、MAPK mRNA和蛋白水平。结果:培哚普利组和白杨素高剂量组心肌梗死范围较模型组明显减小,梗死灶及瘢痕组织明显减少,炎症细胞浸润减少;白杨素低剂量组心肌梗死区仍可见纤维母细胞和纤维细胞,炎性细胞浸润明显。与正常对照组比较,模型组大鼠左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌MMP-2、MAPK mRNA和蛋白表达升高,短轴缩短分数(FS)、射血分数(EF)水平降低(P<0.05);与模型组比较,培哚普利组、白杨素低剂量组、白杨素高剂量组大鼠LVIDd、LVIDs、CK、CK-MB、LDH、心肌MMP-2、MAPK mRNA和蛋白表达降低,FS、EF水平升高(P<0.05);白杨素低剂量组与培哚普利组比较,各指标变化差异有统计学意义(P<0.05)。结论:白杨素对急性心肌梗死大鼠心功能具有明显改善作用,这可能与白杨素抑制心肌MMP-2的表达以及MAPK信号通路的激活有关。

小儿急性肠梗阻肠坏死A2B腺苷受体、紧密连接蛋白Occludin的表达及临床意义

目的 研究小儿急性肠梗阻A2B腺苷受体、紧密连接蛋白Occludin的表达及临床意义.方法 选择医院小儿科收治的30 例急性肠梗阻肠坏死患儿作为治疗组,30 例消化道畸形患儿作为对照组.两组患儿均行肠切除肠吻合术.检测方法：①免疫组化方式检测肠管黏膜上皮细胞中A2B腺苷受体（ A2BAR）、紧密连接蛋白的表达;②蛋白印记（WB）检测两组患儿肠黏膜上皮细胞中p38丝裂原活化蛋白酶（p38MAPK）以及磷酸化p38MAPK （p-p38MAPK）的表达;③酶联免疫吸附测定法（ ELIA）检测术前以及术后7 d 血清中的血清肿瘤坏死因子 α （TNF-α）含量.结果 治疗组患儿A2BAR灰度值（139.33 ±34.06）低于对照组（177.60 ±11.58,P＜0.01）;治疗组患儿Occludin蛋白灰度值（198.63 ±14.23）高于对照组（175.64 ±18.17,P＜0.01）;与对照组比较,治疗组患儿的p38MAPK表达比较差异未见统计学意义（P＞0.05）,p-p38MAPK的表达升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;术前治疗组患儿TNF-α浓度为（95.30 ±9.39）pg/ml,高于对照组的（70.57 ±5.84）pg/ml（P＜0.05）;治疗后7 d治疗组患儿TNF-α浓度与对照组比较差异未见统计学意义（P＞0.05）.结论 小儿急性肠梗阻肠坏死导致缺血缺氧,促进了细胞的凋亡及TNF-α释放,造成A2BAR表达量增多,紧密连接蛋白表达下降,这可能是导致肠道细菌移位的原因.

加味泽泻汤对NAFLD大鼠肝脏炎症信号通路相关蛋白表达的影响

目的:探讨加味泽泻汤对高脂饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型的治疗机制。方法:SPF级大鼠分为空白组、模型组、加味泽泻汤组、多烯磷脂酰胆碱组,大鼠分别以10%或45%高脂纯化饲料喂养12周构建NAFLD模型。加味泽泻汤及多烯磷脂酰胆碱治疗组分别给药4周,空白组及模型组则给予相应体积双蒸水4周。以蛋白免疫印迹(Western blot)法检测Toll样受体4(TLR4),髓样分化因子88(My D88),核转录因子-κB p65(NF-κB p65),p38丝裂原活化蛋白酶(p38MAPK),磷酸化的p38丝裂原活化蛋白酶(p-p38),c-Jun氨基末端激酶(JNK),半胱氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)在大鼠肝脏中的表达。结果:与空白组比较,模型组TLR4,My D88,NF-κB p65,p-p65,p38 MAPK,p-p38,JNK及Caspase-1蛋白表达明显增高(P<0.05);而加味泽泻汤组相应蛋白的表达量较模型组均显著下降(P<0.01)。结论:在高脂饮食诱导的大鼠NAFLD模型中,加味泽泻汤通过抑制TLR4/NF-κB,MAPK信号通路相关蛋白的表达,从而抑制肝脏炎症的产生、缓解肝脏的损伤,达到治疗NAFLD的目的。

痛泻要方对肝郁脾虚型腹泻型肠易激综合征大鼠肠道高敏性的治疗作用

目的 研究痛泻要方对肝郁脾虚型腹泻型肠易激综合征(diarrhea predominant irritable bowel syndrome,D-IBS)大鼠肠道高敏性的治疗作用。方法 采用番泻叶灌服与慢性束缚建立肝郁脾虚型D-IBS大鼠模型,观察痛泻要方对肝郁脾虚型D-IBS大鼠HPA轴的相关指标促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)、血浆促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、皮质醇(cortisol,CORT),结肠组织中p38 MAPK、MSK1磷酸化及cAMP反应原件结合蛋白(cyclic-AMP response binding protein,CREB)表达水平的影响。结果 痛泻要方可以降低肝郁脾虚型D-IBS大鼠CRH、ACTH、CORT含量,抑制结肠组织中p38MAPK,MSK1磷酸化及CREB蛋白的表达,尤以痛泻要方高剂量组最为显著(P<0.05或P<0.01)。结论 痛泻要方对番泻叶灌服与慢性束缚建立的肝郁脾虚型D-IBS大鼠肠道敏感性具有显著降低的作用,其机制可能与下调p38 MAPK、MSK1磷酸化和CREB蛋白的表达,抑制HPA轴亢进有关。