S1P2受体shRNA腺病毒载体的构建及筛选

目的为探讨S1P2受体介导血管内皮细胞衰老的机制,构建和筛选特异性S1P2受体shRNA腺病毒载体。方法设计并合成4对靶向S1P2受体的单链寡核苷酸(ssoligo),经变性退火为双链寡核苷酸(dsoligo)插入穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle载体,测序正确后经脂质体介导转染人肺动脉内皮细胞(HPAEC),通过RT-PCR方法筛选对S1P2受体基因沉默效果最佳的穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA,提取质粒DNA,经双酶切,回收S1P2受体基因沉默效果最佳的shRNA片段,亚克隆到腺病毒表达载体(pAdeno-X),筛选出正确重组子,转染HEK293A细胞,收集重组的腺病毒,测定病毒滴度,通过Westernblot方法检测S1P2受体沉默效果。结果测序结果证实所构建的pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA质粒正确,并从4对dsoligos筛选出对S1P2受体沉默效果最佳的穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA,经亚克隆到腺病毒表达载体。转染人肺动脉内皮细胞后,Western印迹检测显示构建的腺病毒载体pAdeno-shRNA对S1P2受体蛋白的沉默有明显效果。结论成功地构建和筛选出介导特异性shRNA-S1P2的重组腺病毒。

SF1a-PRLR和ΔS2 SF1a-PRLR对乳腺癌MCF-7细胞增殖和microRNA表达的影响

目的:探讨过表达SF1a-PRLR及其变体ΔS2 SF1a-PRLR基因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和micro RNA表达的影响。方法:利用同源重组技术将SF1a-PRLR和ΔS2 SF1a-PRLR c DNA分别重组至慢病毒,再将携带不同基因的重组病毒,即空病毒、携带SF1a-PRLR c DNA和ΔS2 SF1a-PRLR c DNA的慢病毒分别转染MCF-7细胞,经嘌呤霉素多次筛选得到稳定转染细胞株MCF7-con(对照组)、MCF7-SF1a-PRLR(SF1a组)、MCF7-ΔS2 SF1a-PRLR(ΔS2 SF1a组),将3组稳定转染细胞株培养后进行细胞增殖实验,提取总RNA进行小分子RNA高通量测序。结果:增殖实验结果显示,培养48 h时,对照组、SF1a组和ΔS2 SF1a组的D(492)值分别为1.85±0.29、2.24±0.26、2.57±0.23,3组之间两两比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。测序结果显示,各组间micro RNA表达均有显著差异,SF1a组与对照组比较,差异表达的micro RNAs共有176个(32个表达上调,144个表达下调);ΔS2SF1a组与对照组相比,差异表达的micro RNAs共206个(52个表达上调,154个表达下调);ΔS2 SF1a组与SF1a组比较,差异表达的micro RNA共5个(mi R-4454、mi R-215-5p、mi R-797、mi R-622表达上调,mi R-210-5p表达下调),其中,mi R-210-5p在对照组、SF1a组、ΔS2 SF1a组中的相对表达水平分别为66.18、31.67、13.07,两两比较均具有显著差异(P均<0.05)。结论:过表达SF1a-PRLR或ΔS2 SF1a-PRLR均能促进人乳腺癌MCF-7细胞的体外增殖且显著影响人乳腺癌MCF-7细胞的micro RNA表达,两者对大部分microRNA表达的影响作用相似,仅对miR-4454等5个microRNAs的表达具有显著影响。