两步多重RT-PCR快速检测苹果潜隐性病毒

【目的】为建立检测3种苹果潜隐性病毒更为快速准确的方法，【方法】以携带苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）和苹果茎痘病毒（ASPV）的成龄苹果树韧皮部为试材，根据基因库中苹果茎痘病毒（Apple stempitting virus，ASPV）的外壳蛋白基因序列，设计合成了2对特异性引物，分别与合成的苹果茎沟病毒（ASGV）引物和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）的引物组合配伍，筛选出最佳的引物对组合。对eDNA的合成所用引物和总RNA模板进行遴选和量化，对PCR过程中eDNA的用量、引物对的终浓度、退火温度等主要影响因素进行优化。【结果】结果表明，反转录引物为Oligo（dT）18、总RNA0．1～3．0μL时，可以得到较好的eDNA；ASPV—FR与ASGV—Pch、ACLSV—Pch引物组合优于ASPV—Pch，并且筛选出4组最佳的终浓度处理组合；eDNA用量为2．0-4．0μL、退火温度为50．0～52．9℃、循环数为35时，扩增效果较好。采用优化的多重RT—PCR体系对采自陕西和山东两省的样品进行检测，并用3种病毒的单重RT—PCR体系进行验证。【结论】结果呈现高度一致性，充分印证了该多重RT—PCR体系的准确性，适用于大量样品的快速检测。

3种苹果潜隐性病毒一步多重RT-PCR检测体系的优化

为建立更为快速准确的苹果潜隐性病毒检测方法,以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的田间苹果成龄树为试材,设计合成了扩增目的片段为273bp(ASGV)、358bp(ACLSV)和432bp(ASPV)的3对特异性引物,并对影响RT-PCR体系的主要参数进行试验优化。结果表明:建立的一步多重RT-PCR体系可以实现对3种主要潜隐性病毒的特异性检测;通过对田间多个样品的检测验证,表明该方法的准确性和灵敏度都很高,并缩短了单个样品的检测时间,极大地提高了工作效率。