蜜蜂残翅病毒两步法荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种灵敏度更高的蜜蜂残翅病毒两步法荧光定量PCR检测方法,根据残翅病毒保守基因片段设计引物,采取反转录过程与荧光定量PCR过程分步进行的方式,建立基于SYBR染料法检测残翅病毒的两步法实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、稳定性和可行性进行验证。结果显示,建立的两步法荧光定量PCR检测方法采用的引物特异性良好,在6.58×10^(1)~6.58×10^(8)拷贝/μL质粒标准品间具有良好线性关系,R^(2)为0.9997,扩增效率为100.8%。该方法的灵敏度为6.58拷贝/μL,与蜜蜂黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒不发生交叉反应,组内变异系数为0.20%~0.66%,组间变异系数为0.08%~0.98%,对蜜蜂样品残翅病毒的阳性检出率明显高于普通PCR,具有良好的特异性、重复性和实用性。综上,成功建立了一种灵敏度高、适用性好的残翅病毒两步法实时荧光定量PCR检测方法,为我国蜜蜂残翅病的流行病学调查、疫情监测和预警机制的构建提供新的技术支持。

非洲猪瘟病毒一步法巢式锁核酸荧光定量PCR方法的建立

试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列,建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR)的嵌套引物以及探针,并对外引物进行锁核酸修饰。建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件,确立LNA-OSN-PCR标准曲线,并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。采用LNA-OSN-PCR方法,对96份临床疑似患病样品进行检测,同时与普通荧光探针PCR方法进行比较。试验确立并优化了LNA-OSN-PCR的反应条件和体系,建立的LNA-OSN-PCR标准曲线,具有较好的线性(R2=0.9945)。该方法的最低检测限为3×10^(-1)copies/μL,变异系数小于3%,并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应。LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较,检测灵敏度提高10~100倍,在对96份临床疑似患病核酸样品进行检测中,检出55份阳性,41份阴性,比常规的荧光定量PCR具有更高的阳性检出率。并且能获得典型的扩增曲线。试验结合一步法巢式PCR和锁核酸修饰,建立了ASFV一步法巢式锁核酸荧光定量PCR,为检测ASFV提供一种高灵敏度和高特异性且经济实惠的检测方法。

免疫磁分离-两重荧光定量PCR法快速检测鲜猪肉中金葡菌和志贺氏菌

本研究建立了一种6h内从鲜猪肉中富集、提取和检测金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的方法。对鲜猪肉样品进行3h增菌后,在37℃条件下使用金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的免疫磁球,从250mL体系中快速捕获两种目标致病菌,快速提取核酸后,结合特异性引物及探针,使用两重荧光定量PCR法进行检测。结果显示金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的检测限分别达到2.52CFU/g和1.36CFU/g。方法总体灵敏度、特异性和准确度均达到100%,适用于鲜猪肉中金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的快速检测。

一步法实时荧光定量PCR检测大鼠胰腺组织中Insulin mRNA和PDX-1 mRNA的表达

目的通过检测大鼠胰腺组织中Insulin mRNA和PDX-1 mRNA的表达探讨EGF/Gastrin联用促进胰岛PDX-1表达增强可能的作用机制。方法采用一步法实时荧光定量PCR检测各组大鼠胰腺组织中Insulin基因和PDX-1基因在转录水平的表达。结果大鼠胰腺组织中Insulin mRNA在转录水平的表达情况正常对照组最高;糖尿病组最低,与正常对照组相比相差2.4倍(P<0.05);EGF/Gastrin组是糖尿病组的2.1倍(P<0.05)。大鼠胰腺组织中PDX-1mRNA在转录水平的表达情况正常对照组最高,糖尿病组最低,与正常对照组相比相差2.8倍(P<0.05),EGF/Gastrin组是糖尿病组的2.2倍(P<0.05)。结论 EGF/Gastrin联用促进胰岛PDX-1表达增强的作用机制可能通过其改善胰岛β细胞功能、降低血糖进而减弱糖毒性对PDX-1表达的不良影响,间接地使PDX-1的表达增强。而EGF/Gastrin联用促进胰岛新生、改善胰岛β细胞功能又有可能是通过提高PDX-1的表达而实现的。

口蹄疫病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种能快速、高效、敏感、特异地检测口蹄疫病毒（FMDV）的一步法荧光定量RT—PCR检测方法。方法根据FMDV聚合酶3D基因序列比对结果，设计特异性引物和MGB探针；通过优化，得到最佳反应体系和反应条件；分别以质粒和病毒RNA为模板，构建标准曲线；并进行特异性、敏感性、重复性试验。

荧光定量PCR法的优化及其在牛羊源性成分检测中的应用研究

SYBR Green荧光定量PCR法可对含牛羊源性成分饲料进行快速筛选。本文通过优化PCR条件,将原有的三步法简化为两步法,筛选时间由最初的116min减少至67min,并应用于170份饲料样品的检测。经过筛选,排除了166份阴性样品中的162份样品,占97.6%;被怀疑为阳性样品的8份样品中,有4份样品最终被确认为阳性样品。此方法的应用,将提高饲料中牛羊源成分检测的速度和灵敏度,加强了防止疯牛病传播的保障力度。

登革1型和2型病毒混合感染样本的一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立

本文旨在建立检测登革1型和2型病毒的一步法实时荧光定量PCR方法,为登革热的诊断和预测提供技术支撑。依据登革1型和2型病毒的保守区序列设计引物和探针,建立了同时检测两个血清型登革病毒的一步法实时荧光定量PCR方法。特异性实验结果显示,该方法可检测出登1型和2型病毒,与登革3型、4型病毒、黄热病毒、流感H3N2病毒均无交叉反应,具有较好的特异性。对登革1型和登革2型的灵敏度均为102copies/μL。应用该方法,可检测出登革1型和2型病毒混合感染C6/36后不同时间点病毒复制动态。在两个血清型登革病毒混合感染C6/36细胞72~120 h登革2型病毒的拷贝数与单独感染时登革2型病毒的拷贝数相比显著下降。上述研究证实建立的一步法实时荧光定量PCR方法具有特异性好灵敏度高、重复性好等特点,能够用于登革型和2型病毒混合感染样本的检测。

一步法荧光定量PCR快速检测肠道病毒EV71

目的:建立一步法荧光定量RT-PCR方法快速检测肠道病毒EV71。方法:从Genebank中找出最近2-3年中国大陆区域流行的EV71病毒VP1基因的序列进行比对,找出2-3个相对保守区域设计引物及taqman探针。筛选出一套表现良好的引物并进行反应条件的优化。结果:筛选出一套对EV71病毒具有高度灵敏度和特异性的引物及taqman探针,检测灵敏度达10copiesVP1/μL,整个操作过程仅需2-3h。结论:该套引物及探针针对EV71具有良好特性,是用于EV71的日常监测和暴发时的应急诊断。

基于白纹伊蚊Actin基因参照的登革Ⅱ型病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种以白纹伊蚊Actin基因表达量作为参照的登革Ⅱ型病毒一步法实时荧光定量PCR检测技术,为登革病毒在蚊虫中的定量检测提供更准确的检测方法。根据登革Ⅱ型病毒和白纹伊蚊Actin基因保守区序列设计引物和探针,在检测体系中同时加入病毒和Actin基因的特异性引物,计算每个样本中病毒含量与Actin表达量的比值,得到更为准确的定量结果。该方法重复性好、灵敏度高,可用于实验室白纹伊蚊感染登革Ⅱ型病毒的病毒载量检测。

免疫磁分离-两重荧光定量PCR法快速检测鲜猪肉中金葡菌和志贺氏菌

本文即尝试以实验方式,利用免疫磁分离-两重荧光定量PCR法对鲜猪肉样本中的金葡萄球菌以及志贺氏菌进行检测。结果显示:免疫磁分离-两重荧光定量PCR法能够在6.0 h时间内完成对鲜猪肉样本中金葡萄球菌以及志贺氏菌的检测,具有检测过程快速性、检测结果灵敏度高、特异性高以及准确可靠等诸多优势,可作为食品样本中常见食源性致病菌的常规检测方法之一,加以推广应用[1]。

TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用

本研究采用一步DNA提取法快速提取锦鲤组织样品中的DNA,利用针对锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)TK基因保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针,经反应体系优化,应用实时荧光定量PCR检测技术,通过对荧光信号的实时监测实现对KHV的定量检测。整个过程快速、简捷,操作简单,可对KHV进行快速有效的诊断,具有一定的应用价值。

寨卡病毒荧光定量PCR检测方法的建立与验证

目的建立基于一步法实时荧光定量PCR技术的寨卡病毒检测方法。方法通过分析寨卡病毒全基因组核酸序列,根据其NS5基因片段,设计特异性引物,构建重组质粒,经体外转录后获得寨卡病毒RNA,即阳性标准品,建立标准曲线,利用RT-PCR方法对检测体系做灵敏性、重复性试验,以寨卡病毒GZ01毒株与Huh7.5.1细胞RNA混合或加入寨卡病毒的血浆标本对本方法测试。结果建立的标准曲线线性关系良好,灵敏度较高,检测下限可达0.1 PFU/mL,标准曲线方程:Y=-3.353X+36.345,相关系数(CV)可达0.999。该方法特异性较好,对登革病毒和丙肝病毒核酸检测无交叉反应,可检出寨卡病毒感染的细胞样品和血浆样品中的寨卡病毒。结论成功建立了1种基于实时荧光定量PCR的寨卡病毒核酸检测的高灵敏性方法。

两种一步法RNA提取试剂的比较

RNA的提取在生物医学研究和临床检测上应用广泛。本文分别用进口Invitrogen公司生产的以及我们自己研制的一步法RNA提取试剂,提取大肠杆菌RNA、鸡肌肉组织RNA和尿裳液RNA,通过核酸电泳和荧光定量RT-PCR进行比较。结果表明用我们自己研制的和进口的试剂提取的RNA都不含有DNA;这些RNA都可以作为模板进行RT-PCR检测,并且在数量上相互之间没有明显差异。说明我们自己研制的一步法RNA提取试剂可以取代进口试剂。此外,本文还讨论了此类试剂一些评定方法。

一种新型快速定量检测HBV DNA试剂的评价

目的对一种新型快速定量检测HBV DNA试剂进行性能评价。方法以达安公司HBV DNA定量检测试剂(浓缩碱裂解法)为参比试剂,湖南圣湘公司HBV DNA定量检测试剂(一步法)为实验试剂,比较两法对117例临床标本和2012年江苏省室间质评样本检测结果的相关性和准确性。评价一步法PCR试剂的敏感性、特异性、线性关系和重复性。结果两种试剂检测25例HBV DNA阴性标本,结果均为阴性,92例HBV DNA阳性样本中87例两法均为阳性。经以10为底数的对数转换后,一步法检测结果为4.82±1.80,浓缩碱裂解法为4.78±1.89,结果无统计学差异(t=-0.74,P>0.05),且两法相关性良好(r=0.971,P<0.05)。两法特异性均为100%(25/25);一步法敏感性为98.9%(91/92),浓缩碱裂解法为95.7%(88/92);两法检测室间质评样本均在合格范围内。一步法检测试剂的r为0.999;两份HBV DNA阳性样本重复检测10次的变异系数(CV)分别为0.89%和0.15%。结论一步法试剂的检测结果准确可靠,与浓缩碱裂解法试剂相比,操作简便快速。

中国大陆地区乙型脑炎病毒一步法TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是黄病毒科黄病毒属的单股正链RNA病毒，三带喙库蚊是其主要的传播媒介，感染人体后可引起流行性乙型脑炎（乙脑）。人群对本病普遍易感，15岁以下儿童发病率较高。

浓缩一步法新型肺炎支原体核酸检测试剂盒的临床应用初步评价

目的通过对比实验,对新型肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,MP)核酸检测试剂(采用浓缩一步法处理样本,以下简称"浓缩一步法")的临床使用进行评价。方法用浓缩一步法试剂与煮沸法试剂对临床收集的样本进行MP DNA检测并对比其结果,同时,将两种试剂的检测结果分别与金标准培养法检测结果进行对比。结果新型肺炎支原体核酸检测试剂与煮沸法试剂的阳性一致性百分比为98.36%,阴性一致性百分比为96.80%,总一致性百分比为97.68%;对5例不符样本进行测序复核,并对复核后的结果进行Kappa检验一致性分析,结果 Kappa值=1.000,表明新型试剂的检测结果与煮沸法试剂及复核检测的结果具有很好的一致性。在与金标准培养法检测结果的对比中,两种试剂均表现出较好的准确性。结论新型肺炎支原体核酸检测试剂与已上市的煮沸法试剂检测结果具有很好的一致性,操作简单快速,减少污染环节,并具有内标控制假阴性,结果准确,符合临床检测要求,具有较高的临床应用价值。

人自噬基因hAPG_(12)的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的:探讨克隆人自噬基因h APG12 ,构建重组真核表达载体p EGFP- C2 -h APG12 ,为进一步研究h APG12 的功能奠定基础。方法:从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,采用两步法RT- PCR,首先把RNA逆转录为c DNA,而后通过一对h APG12 的特异性引物扩增出目的基因,PCR产物与测序载体p UC18连接后转化到大肠杆菌DH5 α,而后对单菌落进行菌落PCR、酶切和测序鉴定。将测序正确的h APG12 亚克隆入真核表达载体p EGFP-C2 ,该重组载体转化到大肠杆菌DH5 α后进行菌落PCR和酶切鉴定。结果:测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的h APG12 c DNAs含有2 2 5个碱基,与Genbank( BC0 1 1 0 33)序列完全一致。构建的重组真核表达载体经鉴定证实h APG12 基因已完全正确亚克隆到p EGFP- C2 。结论:成功克隆了人自噬基因h APG12 并构建了具有报告基因-增强绿色荧光蛋白( EGFP)基因的重组真核表达载体p EGFP- C2 - h APG12 ,为以后研究h APG12

一种新型HBV—DNA检测方法的性能评价

目的考察及评价一种操作简便快速的HBVDNA荧光定量PCR检测方法（一步法）的性能和临床应用价值。方法同时用一步法和经典的煮沸法检测137例临床样本的HBVDNA荧光定量PCR，比较两种方法的灵敏度、结果的一致性及相关性；检测2014年上半年卫生部临床检验中心HBVDNA室问质控品，考察一步法定值的正确度；采用一步法检测梯度稀释样本，考察其线性范围及灵敏度；采用一步法对两例临床标本重复检测5次，考察其精密度。结果137例样本一步法和煮沸法检测结果的阳性一致性为100％（93／93），阴性一致性为90.91％（40／44），总一致性为97.08％，其中阴阳性不符合的4例标本，采用一步法检测为低浓度阳性，煮沸法检测为阴性。对两种方法检测的结果进行配对T检验分析，t=0．53（P〉0．05），两者结果差异无统计学意义（P〉0．05）。一步法检测卫生部临床检验中心室问质控品，检测结果符合要求，定值准确。一步法分别检测高浓度和低浓度HBV-DNA两例临床样本，重复检测5次，浓度对数值的变异系数分别为CV=0.049％和CV=0.108％，具有很好的精密度。结论HBV一步法具有操作简便、定量准确、灵敏度较高及精密度好等优点，是一种较好的临床HBVDNA快速定量检测方法。

一种新型解脲脲原体核酸检测试剂盒的临床应用初步评价

目的:通过对比实验,对新型解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,UU)核酸检测试剂(采用一步法处理样本,以下简称'一步法')的临床使用进行评价。方法用一步法试剂与煮沸法试剂对176例临床收集的样本进行UU DNA检测并对比其结果,同时,将两种试剂的检测结果分别与培养法结果进行对比。结果新型解脲脲原体核酸检测试剂与煮沸法试剂的阳性一致性百分比为99.00%,阴性一致性百分比为96.05%,总一致性百分比为97.73%;对4例不符样本进行测序复核,并对复核后的结果进行Kappa检验一致性分析,结果Kappa值=1.000,表明新型试剂的检测结果与煮沸法试剂及复核检测的结果具有很好的一致性。在与金标准培养法检测结果的对比中,两种试剂均表现出较好的准确性。结论新型解脲脲原体核酸检测试剂与已上市煮沸法试剂的检测结果阴阳性一致性较好,操作简单快速,减少污染环节,并具有内标控制假阴性,灵敏度更高,结果准确,符合临床检测要求,具有较高的临床应用价值。

乙型肝炎病毒表面抗原cutoff值临界结果的分析及临床意义

目的分析cutoff值介于0.11～0.30之间的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)临界结果,探讨其临床意义。方法用ELISA两步法对46份常规ELISA一步法测得cutoff值介于0.11～0.30之间的HBsAg,以原倍双孔重复检测;并用胶体金HBsAg快速检测试纸条复查,用PCR法检测其HBV DNA的含量。结果用ELISA两步法检测有23份cutoff仍介于0.11～0.30之间,3份阳性;胶体金HBsAg快速纸条测定有16份弱阳性,3份阳性;PCR法有12份HBV DNA拷贝结果大于1000cop-y/mL。结论 cutoff值介于0.11～0.30之间的HBsAg临界结果,其中绝大部分为其真实的HBsAg cutoff值,可反映其病毒含量;小部分是由于试剂或操作引起,应进行复查后才能发出报告,临床医生应重视并作临床的观察和随访。