一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对马铃薯病毒诊断研究的比较

为建立快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR检测马铃薯病毒技术,采用试剂盒和Total试剂2种方法,从马铃薯叶片和茎秆中提取马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的RNA。设计了5种马铃薯病毒引物,同时应用一步法RT-PCR和两步法RT-PCR的反应体系对5种病毒扩增,分别得到620bp(PVX)、550bp(PVY)、435bp(PVS)、300bp(PVA)和222bp(PLRV)的扩增片段。将结果与报道的这5种马铃薯病毒核苷酸序列进行BLAST比对,表明扩增的5种马铃薯病毒靶带的序列与靶序列完全一致。2种诊断方法对马铃薯病毒核酸进行浓度检测,结果证明,两步法RT-PCR具有较高灵敏性。但这2种方法均可快速、简便、有效地诊断马铃薯病毒。

一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对蜜蜂病毒诊断研究的比较

【目的】探讨适合蜜蜂病毒病诊断的RT-PCR技术。【方法】从感染蜜蜂以色列急性麻痹病毒、残翅病毒、囊状幼虫病毒、急性麻痹病毒、黑蜂王台病毒以及慢性麻痹病毒的阳性样品中,分别提取这6种病毒的RNA。然后,同时应用一步法RT-PCR和两步法RT-PCR的反应体系对6种病毒扩增,并对两种方法的灵敏性进行比较和分析。【结果】上述两种方法分别得到158(IAPV)、269(DWV)、342(SBV)、460(ABPV)、536(BQCV)和774 bp(CBPV)的扩增片段,测序结果证实扩增片段符合预期。两步法RT-PCR可检测到更低浓度的病毒颗粒。【结论】结果表明,该2种方法均可快速、有效地诊断蜜蜂病毒。但两步法RT-PCR灵敏性更高。

不同RT-PCR方法学的探讨

目的:探讨微量RNA标本的RT-PCR方法。方法:采集13例新生大鼠脊髓标本,提取RNA,分别稀释至1μg/μl、1ng/μl和1 pg/μl,分别以两步法RT-PCR、Promega公司和Qiagen公司一步法RT-PCR试剂盒,扩增β-actin基因,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外透射仪下观察分析。结果:浓度为1μg/μl和1ng/μl的标本,三种方法均出现了目标带,而浓度为1 pg/μl的标本,两步法RT- PCR、Promega公司和Qiagen公司一步法RT-PCR试剂盒的阳性率分别为85%、77%和100%。结论:一步法敏感性高于两步法,微量RNA标本以采用Qiagen公司的一步法试剂盒进行RT-PCR实验为好。

实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR检测噬菌体MS2的差异

目的:通过比较实时荧光一步RT-PCR和普通的两步法RT-PCR在检测噬菌体MS2时灵敏度和特异性的差异,以期在消毒学、微生物等相关试验中选择灵敏度和特异性能满足所需的一种方法检测噬菌体或类似病毒。方法:采用实时荧光一步RT-PCR法和普通的两步法RT-PCR对噬菌体MS2复制酶基因和衣壳蛋白基因进行检测,比较两种方法对两个基因片段的检测灵敏度和特异性。结果:对于复制酶基因,实时荧光RT-PCR的灵敏度达0.25 pg/μl,普通的两步法RT-PCR为2500 pg/μl;而对于衣壳蛋白基因,前者灵敏度达0.025 pg/μl,后者为250 pg/μl。在所用的10种菌(毒)株的特异性检测中,实时荧光一步RT-PCR法只检测到噬菌体f2和大肠杆菌ATCC15597(MS2的宿主菌)有与噬菌体MS2复制酶基因和衣壳蛋白基因均相应的两种荧光信号,而其它菌(毒)株为阴性结果;两步法RT-PCR电泳图谱只显示出噬菌体f2有一条与噬菌体MS2衣壳蛋白基因相当的条带以及大肠杆菌ATCC15597有一条与MS2复制酶基因大小相当的条带,其它菌(毒)株的电泳图谱无相关条带。结论:对于噬菌体MS2的检测,实时荧光一步RT-PCR法的灵敏度比普通的两步法RT-PCR高104倍,但特异性后者略强于前者。