卵泡液中游离线粒体DNA提取和定量方法的研究

目的探讨影响卵泡液中游离线粒体DNA(cfmtDNA)提取和定量的因素即卵泡液处理和冷冻储存、实时荧光定量PCR(Q-PCR)引物和试剂盒选择。方法收集2016年3月~10月在华中科技大学同济医学院生殖医学中心进行IVF/ICSI的78名患者的卵泡液样本,分别用4种方法(一步离心法、两步离心法、两步离心法的基础上0.22μm及0.45μm过滤器过滤)对样本进行处理。处理后的样本一部分继续后续操作,一部分冷冻储存后再进行相应实验。用硅胶膜离心柱法,(如TIANamp Genomic DNA试剂盒)和磁珠法(如BeaverBeadsTM Circulating DNA试剂盒)分别提取样本DNA,进行Q-PCR,比较线粒体编码的基因ND1和hmito3为引物cfmtDNA定量的差异及相关性。结果一步离心法获得的cfmtDNA浓度显著高于其余三种方法(P<0.05),其余三种方法之间浓度无显著性差异(P>0.05);与冷冻前相比,冷冻后cfmtDNA浓度无显著性差异(P>0.05);ND1引物扩增cfmtDNA所得的浓度平均值显著高于hmito3引物扩增cfmtDNA所得的浓度平均值(P<0.05),ND1引物和hmito3引物扩增cfmtDNA所得的浓度显著相关(r=0.63,P<0.000 1);与TIANamp Genomic DNA试剂盒相比较,BeaverBeadsTMCirculating DNA试剂盒提取cfmtDNA的量显著增加(P<0.05)。结论卵泡液样本的处理方法、引物和试剂盒的选择都会影响卵泡液中cfmtDNA的定量。建议选用两步离心法处理卵泡液,磁珠法提取游离DNA,ND1引物进行cfmtDNA的定量。

中华眼镜蛇神经毒素可溶性微针的制备及体外经皮渗透性研究

目的制备中华眼镜蛇神经毒素(NT)可溶性微针(DMNs-NT),并考察其理化性质及体外透皮性能。方法采用两步离心法制备DMNs-NT,并以微针针体的成形性、机械强度及背衬层的柔韧性为指标,考察硫酸软骨素(CS)与聚乙烯吡咯烷酮(PVP k30)的比例、基质液含水量、背衬层材料;HPLC法测定其载药量,正置光学显微镜表征,并考察稳定性;采用Franz扩散池考察其体外透皮性能。结果通过单因素考察确定DMNs-NT制备的最佳处方工艺为CS与PVP K30比例1∶1、基质材料与加水量比例5∶4、以羧甲基纤维素(CMC)为背衬层材料。DMNs-NT针体呈四棱锥形,表面平整,长度约为500μm,每片含药量为(15.4±0.5)μg,药物位于针体上部,3个月内稳定性良好。离体皮肤渗透结果显示,4 h后DMNs-NT中NT的累积渗透量可达95.8%,而NT溶液几乎没有透过皮肤,证明可溶性微针对NT透皮递送具有良好的促进作用,能有效穿透大鼠离体皮肤。结论制备DMNs-NT机械强度及柔韧性好,实现了大分子药物NT的透皮递送。

微针长度与马钱子碱可溶性微针刺入性能及治疗效果的关联性研究

目的制备不同微针长度(针长)马钱子碱(brucnine,Bru)可溶性微针(Bru-DMNs),探讨针长对微针刺入性能及治疗效果的影响。方法采用两步离心法制备不同针长(350、450、550、650、750、850μm)Bru-DMNs。通过铝箔及鼠皮穿刺实验考察各针长微针穿刺性能;在体溶解实验考察各针长微针溶解性能;皮肤HE染色观察各针长微针刺入皮肤的深度;皮肤屏障恢复实验评估各针长微针对皮肤角质层的影响;采用Franz扩散池考察各针长微针体外透皮性能;体内药效学评估各针长微针对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的治疗作用。结果350、850μm针长微针穿刺效果较差,450、550、650、750μm针长微针穿刺性能较佳,能成功刺入皮肤形成微孔通道成功递送药物,刺入皮肤后可快速溶解,微针越长,溶解越快;针长越长,刺入皮肤越深,皮肤角质层孔道闭合越慢(4~6 h);450μm针长微针促渗效果较差,长度达到550μm时即有较好促渗效果;各针长微针均可不同程度缓解和治疗RA,长度达到550μm时即可达到理想疗效。结论当微针长度达到550μm时,各项性能良好,具有显著的促渗效果和治疗效果。

雷公藤甲素自溶性微针的制备及体外经皮渗透性研究

雷公藤甲素(triptolide,TP)是中药雷公藤属植物的主要活性和毒性成分,具备生物利用度低以及吸收差、血药浓度难以达到治疗浓度、致死量小等特点。微针(microneedles,MNs)作为一种集注射与透皮为一体的物理促渗技术,其中的自溶性微针(dissolving microneedles,DMNs)还可根据治疗需求制作不同降解速度的自溶性微针。该文将雷公藤甲素与自溶性微针结合,采用两步离心法制备DMNs-TP,并以成型性和机械性能作为考察指标,考察制备DMNs的基质比例、基质液的含水量、脱模方法及塑形剂的种类等。用HPLC测定其载药量,光学显微镜表征,并用H&E染色考察其机械性能,采用Franz扩散池考察其体外透皮性能。通过实验确定DMNs-TP背衬层的最佳处方为PVP-PVA,两者比例为3∶1,基质与水比例为3∶4,DMNs-TP针体呈四棱锥形,表面平整,长度约为550μm,每片面积为2.75 cm^(2),含药量为(153.41±2.29)μg,药物位于针体上部。离体皮肤渗透结果显示,24 h后DMNs-TP中TP的累积渗透量可达80%,而TP溶液则透过很少。实验证明微针对TP透皮递送具有良好的促进作用,能有效穿透大鼠离体皮肤。

雷公藤多苷自溶性微针的制备及质量控制的方法学考察

目的:对两步离心法制备的雷公藤多苷自溶性微针中总二萜及总生物碱的含量进行测定。方法:采用紫外可见分光光度法,分别选择雷公藤甲素、雷公藤次碱为对照,雷公藤多苷样品经适当预处理后测定其中各有效部位的含量。结果:每片面积为2.75 cm2的雷公藤多苷自溶性微针中含总二萜2.17±0.11μg,总生物碱210.76±2.46μg。结论:首次将雷公藤多苷与微针剂型结合,雷公藤多苷自溶性微针中总生物碱的含量大于总二萜,微针中所含的总生物碱的含量为总二萜的100倍左右。