一步等位基因特异扩增法检测中国人N-乙酰化酶基因型

目的建立简化的一步等位基因特异扩增法(ASA),研究中国人N-乙酰化酶(NAT2)多态性等位基因的分布。方法用一步法直接检测215名中国健康人NAT2 *5,*6,*7等位基因。结果一步法测定结果与两步法一致。215名健康中国人NAT2 *5,*6,*7 3种突变型等位基因的基因频率分别为3.3％,24.6％和10.0％。基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子分别为85,96和34人,分别占39.5％,44.7％和15.8％。结论一步法测定NAT2基因准确、方便,为临床个体化合理用药提供理论基础。

等位基因特异扩增法研究中国人CYP2D6中速代谢的相关基因

目的 建立CYP2D6 10B的等位基因特异扩增法 (ASA PCR) ,以探讨中国人CYP2D6中速代谢的基因分型。方法 采用两步扩增法得到CYP2D6 10B等位基因特异片段 ,分析健康中国汉族人CYP2D6 10B等位基因 ,并探讨基因分型结果与右美沙芬表型分型结果的相关性。结果 35名表型为极快代谢受试者 (VEMs)中 ,CYP2D6 10B以杂合子 (wt/m)为主占 5 7% ;2 9名中速代谢受试者 (IMs)以突变型纯合子 (m/m)为主占 6 9% ;慢代谢受试者 (PM)基因型为m/m。CYP2D6 10Bm/m组的MR明显大于wt/m组和野生型组 (wt/wt)。结论 ASA PCR法有快速、准确的优点 。

等位基因特异扩增法检测移植患者多药耐药基因多态性

目的:建立等位基因特异扩增法(Allele-Specific Amplification,ASA-PCR)研究移植患者多药耐药基因(multi-drug re- sistance gene,MDR1)多态性。方法:用ASA-PCR对177位肝、肾移植患者的MDR1第26外显子C3435T、第21外显子G2677T/A位点和第12外显子C1236T位点进行基因分型。结果:ASA-PCR测定结果与聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性方法(Polymerase chain reaction-Restriction Fragment Analysis,PCR-RFLP)的测定结果一致。177例移植患者DNA标本中,C3435T:CC型69例(39.0%),CT型92例(52.0%),TT型16例(9.0%);G2677T/A:GG型39例(22.0%),GT型48例(27.1%),TT型32例(18.1%),GA型30例(16.9%),AT型24例(13.6%),AA型4例(2.3%);C1236T:CC型23例(13.0%),CT型88例(49.7%),TT型66例(37.3%)。结论:采用ASA-PCR检测移植患者MDR1多态性准确、方便,可为临床个体化用药提供理论依据。

PCR——四步两段扩增法分离人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)基因

引物是决定 PCR 结果的关键。本实验中,引物Ⅰ、Ⅱ虽有26个碱基,但由于其5’端有8个碱基为限制性内切酶的识别序列。所以实际上只有18个碱基与原始模板互补配对。采用标准的 PCR 方法时不能产生理想结果。经采用 PCR——四步两段扩增法从人胎盘cDNA 文库中分离得到—484bp 的 DNA 片段。通过斑点杂交鉴定,结果表明该 DNA 片段为 hbFGF 基因。

两步扩增法在玉米抗大斑病相关基因片段分离中的应用

对一步扩增法和两步扩增法在DDRT-PCR中的扩增效率进行了比较,结果发现,两种方法得到的片段大小都在150～1500bp之间,但条带数量和清晰度不同.一步扩增法得到扩增条带为30～45条,条带较模糊,两步扩增法得到的扩增条带为40～60条,条带清晰.一步扩增法获得10条玉米抗大斑病差异表达条带,只有55条带中的cDNA能够成功回收并产生有效扩增,差异条带回收率53.9%,而两步扩增法获得了148条差异条带,其中138条带都能得到有效回收和扩增,回收率达93.2%.因此,步扩增法更有利于差异条带的回收和二次扩增.

突变阻断扩增法检测中国人CYP2D6*10、*14等位基因

目的根据突变阻断扩增原理,建立用于检测中国人CYP2D6*10及*14等位基因的方法。方法采用单管四引物法检测CYP2D6*10等位基因,建立等位基因特异扩增法检测CYP2D6*14等位基因,检测295名健康中国汉族人CYP2D6*10等位基因。结果CYP2D6*10及*14等位基因基因频率分别为55.8%和1.8%,295位受试者中包括1位*14/*14、6位*1/*14、3位*10/*14,基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=2.15,df=5,P>0.82)。结论本室建立的CYP2D6*10、*14等位基因分析法具有方便快捷、结果准确可靠的特点。

单核苷酸多态性分析方法

SNP是第三代遗传标记,在法庭科学及其领域中具有重要作用。当前,已建立了许多SNP分析方法,本文介绍变性高压液相色谱法、时间飞行质谱熔解曲线法、熔解温度曲线法、等位基因特异扩增结合熔解曲线法、分子信号和TaqMan等新的SNP分析方法。

微小按蚊A、C的PCR和同工酶鉴别比较研究

目的比较PCR和同工酶两种鉴别微小按蚊A、C亲缘种的方法。方法将现场采集后经形态初步鉴定为微小按蚊的样本,经PCR产物酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)与乌头按蚊和杰普尔按蚊区分,等位基因特异扩增法(PCR-ASA)进一步鉴别微小按蚊A和C。再将用此方法鉴别后的微小按蚊羽化24h内单只虫体样本,采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳,加以辨别区分。结果经测序验证,PCR方法可以简单明确地将微小按蚊A、C加以鉴别。几种用于鉴别的同工酶中,只有酯酶(EST)同工酶对微小按蚊A、C具鉴别意义。结论对于微小按蚊A、C的鉴别,PCR方法明显优于同工酶方法。

聚合酶链式反应在小鼠雄性胚胎性别鉴定中的优化研究

为了提高聚合酶链式反应(PCR)在小鼠雄性胚胎性别鉴定中的应用效果,试验利用单一扩增雄性特有Sry基因法选取60枚雄性胚胎,将其中40枚平均分为2组,试验组1利用双重基因扩增法进行复检,试验组2利用两步双重基因扩增法进行复检,比较这2种方法对雄性胚胎的鉴定效果;利用两步双重基因扩增法分别以1,2,3个卵裂球模板量对其余20枚雄性胚胎进行体外扩增,确定卵裂球的适宜使用量。结果表明:利用两步双重基因扩增法进行雄性胚胎判定的准确率为100%,显著高于双重基因扩增法的准确率(85.00%)(P<0.05)。以3个卵裂球作为模板时的准确率为100%,可以成功复检所有雄性胚胎。因此,利用两步双重基因扩增法可以有效对小鼠雄性胚胎进行性别鉴定。

中国健康人群葡萄糖醛酸转移酶1A3基因多态性的测定与分析

目的建立葡萄糖醛酸转移酶1A3(UDP-glucuronosyltransferase,UGT1A3)一号外显子上-31T/C、-133C/T及-140T/C 3个位点基因型的检测方法,考察这3个位点的基因多态性在中国健康人群中的发生频率。方法 采用两步等位基因特异扩增法[two-step allele specific amplification(ASA)],设计葡萄糖醛酸转移酶1A3一号外显子的引物扩增基因组DNA,在此基础上针对每一个位点设立两个分别含有野生型或突变型引物的平行反应管,各包含一条3'端最后一位碱基分别与野生型或突变型配对的上游引物及一条相同的下游引物来扩增目的基因,采用1%琼脂糖凝胶电泳考察不同引物的扩增情况,以区分位点基因型,并抽样进行直接焦磷酸测序以验证方法的准确性。结果 123例(男89例,女34例)无亲缘关系的健康受试者中-31位点等位基因T和C的频率分别为0.776和0.224,-133位点等位基因C和T的频率分别为0.935和0.065,-140位点等位基因T和C的频率分别为0.915和0.085。UGT1A3*1/*1、UGT1A3*1/*2、UGT1A3*2/*2、UGT1A3*1/*4及UGT1A3*4/*4携带者分别有59名、17名、1名、12名及1名。结论 中国健康人群中葡萄糖醛酸转移酶1A3一号外显子-31、-133及-140位点存在遗传多态性;本试验建立的基因型测定与分析方法特异、准确,可满足UGT1A3遗传多态性研究的需要。