环孢菌素A抑制大鼠胰岛素分泌的体外实验研究

目的 探索环孢菌素A抑制胰岛素分泌的分子机制。方法 经胆管不离体灌注胶原酶消化分离Wistar大鼠胰岛，环孢菌素A（0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/ml）干预不同时间后，吖啶橙/碘化丙锭染色，未经环孢菌素A处理的胰岛作为对照组，荧光显微镜下观察胰岛细胞存活变化。对照组和1.0 μg/ml环孢菌素A干预组中的胰岛分别孵育24 h后，进行高糖刺激胰岛素分泌实验；通过实时定量PCR方法探测P糖蛋白基因（abcb1b）、凋亡基因（casp3、Bcl-2）、胰岛素合成相关基因（pdx1、ins1、ins2）和胰高血糖素基因（glucagon）表达量的变化；通过罗丹明细胞内聚集实验评估P糖蛋白外排泵功能。结果通过胰岛存活状态的观察，确定1.0 μg/ml环孢菌素A为合适的干预浓度。环孢菌素A干预对体外胰岛高糖刺激下的第一时相分泌无抑制，而对第二时相抑制作用显著（P〈0.01）。环孢菌素A干预24 h后，abcb1b、ins1、ins2、pdx1、glucagon、casp3表达量均无变化；Bcl-2基因较对照组下调明显（P〈0.01）；环孢菌素A干预24 h后胰岛细胞内罗丹明聚集量的显著增加（P〈0.01）。结论 环孢菌素A干预抑制胰岛素第二相分泌，凋亡基因Bcl-2表达的变化是关键因素之一。胰岛素分泌的变化与P糖蛋白的表达、胰岛素合成及胰高血糖素无关，但是环孢菌素A对P糖蛋白功能的影响非常显著，不能排除P糖蛋白调节胰岛素分泌的可能性。

大鼠胰岛β细胞中mini-P糖蛋白的表达及其功能研究

目的探讨大鼠胰岛β细胞中65kDa的mini-P糖蛋白存在的可能性及其在两相胰岛素分泌中的作用。方法分别提取Wistar大鼠胰岛、胰腺及INS-1细胞中的总RNA,RT-PCR法检测多药耐药基因1(MDR1)的表达;萃取大鼠胰岛及INS-1细胞蛋白,用P糖蛋白特异性抗体C219行免疫印迹实验,检测P糖蛋白和mini-P糖蛋白的表达;体外胰岛刺激实验测定两相胰岛素分泌。结果在提取的大鼠胰岛、胰腺及INS-1细胞中均扩增出了MDR1基因。在胰岛匀浆蛋白中探测到65kDa的mini-P糖蛋白,在INS-1细胞蛋白萃取液中探测到了160kDa的P糖蛋白。在体外胰岛刺激实验中,P糖蛋白拮抗剂环孢菌素A抑制了胰岛素第二时相分泌,但第一时相分泌无明显变化。结论在INS-1细胞中有P糖蛋白的表达,在大鼠胰岛中有mini-P糖蛋白的表达,与胰岛素的两相分泌相关。