肉及肉制品中肠致病性大肠杆菌两重PCR检测方法的建立

目的 建立肉及肉制品中(EPEC)的快检方法。方法 以EPEC特异的微绒毛粘连基因(eaegene)和菌毛束形成编码基因(bfpgene)作为模板,设计两对引物对肉及肉制品中的EPEC进行特异性扩增。结果 该方法特异性好,对肉及肉制品中EPEC的最低检出量为10cfu g ,检出时间为8～17小时。结论 建立了可检测肉及肉制品中EPEC的快速、敏感、特异PCR方法。

利用单线虫两重PCR技术对秀丽隐杆线虫线粒体DNA拷贝数进行相对定量的方法

目的基于单线虫两重PCR技术,利用细胞核DNA(nDNA)作为内参研究秀丽隐杆线虫线粒体相对数量的实验条件,进而建立一种相对定量秀丽隐杆线虫线粒体DNA(mtDNA)拷贝数的方法。方法首先以秀丽隐杆线虫nDNA和mtDNA序列为模板,利用多重PCR引物设计软件MPprimer和引物特异性评估软件MFEprimer V2.0设计两重PCR引物;然后针对以单线虫为PCR扩增模板的处理条件进行摸索,包括蛋白酶K的消化浓度及反应时间;最后研究秀丽隐杆线虫nDNA片段和mtDNA片段扩增后到达平台期的时间,进而比较不同循环数扩增下秀丽隐杆线虫线粒体拷贝数相对定量的可行性。结果单线虫经蛋白酶K 60℃消化及95℃灭活处理后,能较特异地扩增出nDNA和mtDNA;单线虫PCR模板的处理条件为50μg/ml蛋白酶K 60℃处理2 min并于95℃灭活10 min;线粒体拷贝数相对nDNA而言,趋于稳定的PCR循环数为26。结论建立了一种以为nDNA内参快速相对定量线粒体拷贝数的方法,为线粒体DNA拷贝数相关的实验研究提供了技术支撑。

两重巢式PCR检测母体外周血中胎儿游离DNA

使用两重巢式PCR技术检测母体外周血中胎儿游离DNA，为非损伤性产前鉴定胎儿性别和诊断单基因疾病奠定基础．采用改良的chelex100方法提取60例孕龄为16～36周孕妇的外周血浆中游离胎儿DNA，依据NCBIX染色体长臂ATL1位点，Y染色体上DYS14位点序列，设计并合成引物，用巢式PCR同时扩增2个基因片段，以鉴定胎儿性别．结果表明；有ATL1位点和DYS14位点的扩增产物261bp和198bp鉴定为男性胎儿，而仅有261bp扩增产物鉴定为女性胎儿．均以真实出生性别进行确认后发现，此方法能有效提高检测特异性．两重巢式PCR能够简便并准确地鉴定胎儿性别，对单基因疾病特别是X-连锁遗传病的诊断有积极意义．

免疫磁分离-两重荧光定量PCR法快速检测鲜猪肉中金葡菌和志贺氏菌

本文即尝试以实验方式,利用免疫磁分离-两重荧光定量PCR法对鲜猪肉样本中的金葡萄球菌以及志贺氏菌进行检测。结果显示:免疫磁分离-两重荧光定量PCR法能够在6.0 h时间内完成对鲜猪肉样本中金葡萄球菌以及志贺氏菌的检测,具有检测过程快速性、检测结果灵敏度高、特异性高以及准确可靠等诸多优势,可作为食品样本中常见食源性致病菌的常规检测方法之一,加以推广应用[1]。

乳品中致病大肠杆菌荧光双重PCR技术建立

建立乳及乳制品中致病性大肠杆菌(EPEC)的快检方法。以EPEC特异的微绒毛粘连基因(eae gene)和茵毛束形成编码基因(bfp gene)为模板,设计两对引物,荧光探针对EPEC进行特异性扩增。该方法快速,特异性好,对EPEC的最低检出量为1 cfu/μL(纯菌),检出时间为3 h,同一样品重复检测3次ct值的变异系数均小于5%。建立可快速特异检测乳及乳制品中EPEC的双重荧光PCR方法。

SSR分子标记高效选择抗稻瘟病双基因Pi-1、Pi-2的技术体系

[目的]建立高效SSR分子标记检测技术体系,加快抗稻瘟病育种进程,并为促进、推广SSR分子标记辅助选择技术在企业育种科研上的应用提供方法。[方法]采用田间叶片快速DNA提取技术、抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2连锁标记MRG4766和AP22的两重PCR技术及两道聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对抗稻瘟病育种群体进行高效分子标记辅助选择。[结果]建立了一种成本低、操作简单、能够对抗稻瘟病双基因Pi-1和Pi-2进行准确、稳定、快捷、规模化检测的方法。[结论]该技术体系可对抗稻瘟病育种群体进行高效分子标记辅助选择,加快抗稻瘟病育种进程,为SSR分子标记辅助选择技术在企业育种科研上的广泛应用提供了借鉴方法。