两面神激酶2-信号传导及转录激活蛋白3信号通路在先天性巨结肠相关性小肠结肠炎中的作用

目的探讨两面神激酶2-信号传导及转录激活蛋白3(JAK2-STAT3)信号转导通路在先天性巨结肠相关性小肠结肠炎发病中的作用。方法2019年2月至11月选择21 d龄内皮素受体B(Ednrb)基因敲除小鼠(先天性巨结肠模型鼠)作为实验组(12只),相应日龄野生型小鼠作为对照组(12只)。基因敲除小鼠(背景B6:129)由美国俄亥俄州立大学全国儿童医院捐赠,并在华中科技大学同济医学院动物实验中心培育、繁殖。收集结肠标本,依据形态将实验组小鼠结肠分为狭窄段及扩张段,对照组小鼠肠管相应分为结肠远、近段。苏木精-伊红(HE)染色法判断肠管炎症程度;酶联免疫吸附法(ELISA)进行定量分析各组结肠标本中白细胞介素(IL)-10的表达量;蛋白质印迹法(Western blot)检测各组结肠标本磷酸化两面神激酶2(p-JAK2)、JAK2、磷酸化信号传导及转录激活蛋白3(p-STAT3)、STAT3的蛋白表达水平;实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测JAK2、STAT3的mRNA水平。组间比较采用t检验。结果Western blot结果发现先天性巨结肠模型鼠(Ednrb-/-小鼠)狭窄段肠管JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表达水平较扩张段明显升高,差异有统计学意义(狭窄段:0.791±0.108、0.438±0.059、0.327±0.028、0.858±0.091,扩张段:0.479±0.109、0.206±0.024、0.297±0.013、0.579±0.102,t=7.074、12.679、3.428、7.096,P值均<0.05)。RT-qPCR检测显示Ednrb-/-小鼠结肠狭窄段JAK2、STAT3的mRNA表达水平高于扩张段,差异有统计学意义(狭窄段:0.427±0.042、0.272±0.044,扩张段:0.234±0.031、0.127±0.014,t=12.820、10.836,P值均<0.05)。ELISA显示Ednrb-/-小鼠扩张段肠管的IL-10的表达量下降,而狭窄段肠管升高,差异有统计学意义(狭窄段:2.540±0.710,扩张段:1.330±0.350,t=5.284,P<0.05)。结论先天性巨结肠小鼠模型扩张段炎症重,而狭窄段炎症较轻,其机制与JAK2-STAT3信号转导通路被抑制和激活有关。

两面神激酶2/信号传导及转录激活因子3信号通路在地塞米松诱导成骨细胞MC3T3-E1凋亡中的作用

目的探讨两面神激酶2/信号传导及转录激活因子3(JAK2/STAT3)信号通路在地塞米松(DEX)诱导成骨细胞MC3T3-E1凋亡中作用机制。方法将成骨细胞MC3T3-E1分为3组,分别为对照组、DEX组、DEX+AG490组。对照组只加入正常培养基,DEX组加入200μmol/L的DEX培养,DEX+AG490组预先给予50μmol/L的AG490处理后加入200μmol/L的DEX培养。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白印迹法检测通路蛋白及凋亡蛋白的表达。组间比较采用t检验。结果对照组、DEX组、DEX+12.5、25、50、75μmol/L的AG490的细胞存活率分别为(97.74±1.45)%、(52.05±5.50)%、(54.98±3.77)%、(70.99±4.15)%、(81.53±6.43)%、(79.16±7.35)%。表明DEX明显使成骨细胞MC3T3-E1活力降低(t=11.364,P<0.001),50μmol/L JAK2/STAT3通路抑制剂(AG490)明显抑制了DEX对成骨细胞MC3T3-E1活力的降低作用(t=4.928,P<0.01)。对照组、DEX组、DEX+AG490组的细胞凋亡率分别为(6.067±0.545)%、(26.233±2.631)%和(8.463±1.179)%。表明DEX明显诱导成骨细胞MC3T3-E1凋亡(t=12.999,P<0.001),经AG490处理后,DEX诱导的成骨细胞MC3T3-E1凋亡明显受到抑制(t=10.675,P<0.001)。蛋白质印迹法(Western blot)检测正常组、DEX组、DEX+AG490组p-JAK2蛋白表达分别为1.000±0.323、2.839±0.640、0.286±0.068,p-STAT3蛋白表达分别为1.000±0.245、3.471±0.157、0.618±0.078,bax蛋白表达分别为1.000±0.083、6.571±0.405、3.048±0.905,bcl-2蛋白表达分别为1.000±0.086、0.207±0.040、0.563±0.083,cleaved Caspase-3蛋白表达分别为1.000±0.192、5.685±0.699、3.411±0.247。DEX组较对照组p-JAK2、p-STAT3、cleaved Caspase-3、bax的表达明显增加,bcl-2的表达明显减少(t=4.429、14.912、11.100、23.561、14.565,P<0.05),AG490+DEX组较DEX组p-JAK2、p-STAT3、cleaved Caspase-3、bax的表达明显减少,bcl-2的表达明显增加(t=6.860、28.404、5.262、6.185、6.721,P<0.01)。结论DEX通过JAK2/STAT3信号通路,调节cleaved Caspase-3、bax、bcl-2的表达,诱导成骨细胞MC3T3-E1凋亡。

抗NO生成的JAK3抑制剂的合成及其抗炎活性研究

为了探索抗一氧化氮(NO)生成的两面神激酶3(JAK3)抑制剂的抗炎效果,采用药效团拼接原理设计并合成5个7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物。体外活性评价表明,化合物N-(3-((5-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)苯基)丙烯酰胺(D3)和N-(3-((5-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)苯基)乙酰胺(D4)不仅能有效地抑制NO的合成(5.13±0.48)μmol/L,D4:IC_(50)=(4.67±0.98)μmol/L),对RAW264.7细胞毒性较低(IC_(50)>60μmol/L),而且可以微弱抑制JAK3激酶活性(D3:IC_(50)=272 nmol/L,D4:IC_(50)=849 nmol/L)。其中,化合物D4对角叉菜胶诱导小鼠模型的急性抗炎能力优于D3,可作为抗NO生成的JAK3抑制剂的先导化合物继续研发。

氯化两面针碱通过JAK2/STAT3信号通路对胶质瘤细胞上皮-间质转化的抑制作用

目的:探讨氯化两面针碱(NC)对胶质瘤细胞上皮-间质转化(EMT)的抑制作用,并阐明抑制作用的信号机制。方法:体外培养人胶质瘤U87细胞,分为对照组(不做处理)、EMT组[转化生长因子β1(TGF-β1)诱导胶质瘤细胞EMT]和不同浓度(2.5、5.0、7.5和10.0μmol·L^-1)NC组(不同浓度NC+10μg·L^-1 TGF-β1)。处理48 h后采用划痕愈合实验、Transwell侵袭实验和Western blotting法分别检测各组细胞中细胞迁移率、侵袭率及EMT相关蛋白和两面神激酶2/信号转导及转录活化因子3(JAK2/STAT3)通路相关蛋白[JAK2、磷酸化JAK2(p-JAK2)、STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)]表达水平。在诱导U87细胞发生EMT时,应用STAT3抑制剂WP1066阻断JAK2/STAT3通路,将U87细胞分为对照组(不做处理)、EMT组(加入10.0μg·L^-1 TGF-β1)和EMT+WP1066组(加入10μg·L^-1 TGF-β1和8μmol·L^-1 WP1066),采用Western blotting法检测各组细胞中EMT相关蛋白表达水平。结果:与对照组比较,EMT组细胞迁移率和侵袭率明显升高(P<0.01);与EMT组比较,不同浓度NC组细胞迁移率和侵袭率明显降低(P<0.01)。与对照组比较,EMT组U87细胞中E-钙黏蛋白表达水平降低(P<0.01),N-钙黏蛋白、波形蛋白和β-连环蛋白及诱导EMT的转录因子Snail和Twist1蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01);与EMT组比较,不同浓度NC组细胞中E-钙黏蛋白表达水平升高(P<0.05或P<0.01),N-钙黏蛋白、波形蛋白和β-连环蛋白以及转录因子Slug、Snail和Twist1蛋白表达水平明显降低(P<0.01),且呈浓度依赖性,7.5μmol·L^-1 NC即能明显抑制胶质瘤细胞EMT。与对照组比较,EMT组细胞中JAK2和p-JAK2蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),STAT3和p-STAT3蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与EMT组比较,不同浓度NC组细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。STAT3抑制剂WP1066阻断JAK2/STAT3通路实验中,与EMT组比较,EMT+WP1066组细胞中E-钙黏蛋白表达水平明显升高(P<0.01),N-钙黏蛋白、波形蛋白、β-连环蛋白和转录因子Slug、Snail和Twist1蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:NC能抑制胶质瘤细胞EMT过程,该抑制作用是通过JAK2/STAT3信号通路实现的。

信号转导及转录活化因子3研究进展

信号转导及转录活化因子3(signal transducers and activators of transcnption,STAT3)是一类由750～795个氨基酸组成的DNA结合蛋白,有α、β和γ三种亚型。STAT3广泛表达于不同类型的细胞和组织中,参与细胞生长、恶性转化、凋亡等生理功能和病理过程的调控。现已在中枢神经系统疾病、白血病、肿瘤等多种疾病中发现STAT3表达及活化异常。

CXCL9在新疆寻常型银屑病患者中的表达

目的比较新疆地区寻常型银屑病患者皮损及正常人群皮肤中干扰素伽玛诱导的单核细胞因子(CXCL9)的表达差异。方法 Envision免疫组织化学法(IHC)检测新疆寻常型银屑病患者皮损及正常人皮肤中CXCL9的表达情况。结果与正常皮肤组织相比,CXCL9在寻常型银屑病皮损中的表达明显增加,主要以真皮乳头顶端为主,且差异具有明显统计学意义(χ2=34.80,P<0.01);新疆地区汉族寻常型银屑病患者和维吾尔族寻常型银屑病患者皮肤组织中CXCL9的表达差异无统计学意义(χ2=1.64,P>0.05)。结论新疆寻常型银屑病患者皮损中CXCL9的表达升高,通过JAK/STAT信号通路在寻常型银屑病的炎症反应中发挥重要作用;但汉族和维吾尔族寻常型银屑病患者皮损中CXCL9的表达相似。

基于EGFR/JAK1/STAT1信号通路探讨柴芍六君汤治疗慢性萎缩性胃炎肝郁脾虚证大鼠的机制

目的:基于表皮生长因子受体(EGFR)/两面神激酶1(JAK1)/信号传导与转录激活因子1(STAT1)信号通路探讨柴芍六君汤治疗慢性萎缩性胃炎(C A G)肝郁脾虚证大鼠的机制。方法:采用化学药物诱导配合饥饱失常及夹尾刺激法建立C A G肝郁脾虚证大鼠模型,将成模大鼠按随机数表法分为模型组、维酶素组(240 mg·kg^(-1)·d^(-1))和柴芍六君汤组(5.1 g·kg^(-1)·d^(-1)),灌胃给药28 d后取材。HE染色观察胃黏膜组织病理改变;ELISA检测血清白细胞介素(IL)-6及IL-1β含量;q-PCR和Western Blot检测胃黏膜组织EGFR/JAK1/STAT1信号通路的mRNA和蛋白表达水平。结果:模型大鼠胃黏膜组织固有层腺体萎缩、减少、排列紊乱,炎症细胞浸润明显,主、壁细胞丢失;与正常组比较,模型组血清IL-6、IL-1β含量显著升高(P<0.01);胃黏膜组织EGFR、JAK1、STAT1 mRNA及蛋白水平升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,柴芍六君汤能够减轻CAG肝郁脾虚证大鼠胃黏膜组织固有层腺体萎缩及炎症细胞浸润,降低血清IL-6、IL-1β和下调胃黏膜组织EGFR、JAK1、STAT1 mRNA及蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),整体作用优于维酶素。结论:柴芍六君汤能够改善CAG肝郁脾虚证大鼠胃黏膜组织病理形态,下调炎症因子水平,其机制可能与EGFR/JAK1/STAT1信号通路抑制有关。

JAK2／STAT3信号通路对非小细胞肺癌血管生成的影响

目的探讨两面神激酶2／信号转导及转录活化因子3（JAK2／STAT3）信号通路与非小细胞肺癌（NSCLC）微血管形成之间的关系，以及干预JAK2／STAT3信号通路对血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达的影响。方法应用免疫组织化学方法检测68例NSCLC和27例正常肺组织中P—JAK2、P—STAT3的表达及微血管密度（MVD）值，并分析与各临床、病理参数的关系；使用不同浓度的JAK2抑制剂AG490处理人肺腺癌细胞A549后，M1Tr法检测细胞的增殖状态，Westernblot法检测JAK2／STAT3信号通路的活化状态，RT—PCR法检测AG490对VEGF、bFGF mRNA的表达的影响；在A549细胞中转染STAT3小干扰RNA（siRNA），Westernblot法检测STAT3及磷酸化-STAT3（P—STAT3）蛋白的表达，RT—PCR法检测VEGF、bFGF mRNA的表达。结果NSCLC的免疫组化结果显示JAK2／STAT3信号通路的活化与MVD计数正相关（P〈0．05）；使用AG490和STAT3 siRNA干预该通路的活化后，VEGF和bFGF mRNA的表达下降（P〈0．05）。结论JAK2／STAT3信号转导通路与肺癌微血管生成密切相关，阻断该通路的活化能抑制血管生成相关因子的表达，提示JAK2／STAT3信号通路是抑制肺癌微血管生成的重要靶点。

清燥救肺汤对Lewis肺癌小鼠EGFR,NF-κB,ICAM-1表达及JAK1,STAT1蛋白磷酸化的影响

目的:观察清燥救肺汤对荷Lewis小鼠肺癌瘤重、瘤指数、检测核转录因子-κB(NF-κB),细胞间黏附分子-1(ICAM-1),两面神激酶1(JAK1),表皮生长因子(EGFR)表达及信号传导及转录激活因子1(STAT1)蛋白磷酸化的影响。方法:雄性C57BL/6J小鼠50只,随机分为模型组,化疗[50 mg·kg^(-1)·(2 d)-1]组,清燥救肺汤高、中、低剂量(15.2,7.6,3.8 g·kg^(-1)·d^(-1))组,每组10只。右腋下注射细胞建立荷Lewis肺癌小鼠模型,清燥救肺汤组以相应剂量造模前2周开始灌胃给药,环磷酰胺(CTX)组以CTX相应剂量腹腔注射给药,隔日1次,模型组以等体积生理盐水灌胃给药,2周后处死各组小鼠并取瘤组织,称定质量计算瘤指数,免疫组化法检测NF-κB蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测ICAM-1 mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测EGFR,p JAK1及p STAT1蛋白表达。结果:与模型组比较,清燥救肺汤高、中剂量组及CTX组瘤重、瘤指数显著降低(P<0.01),清燥救肺汤高、中剂量组及CTX组NF-κB蛋白表达,EGFR蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),清燥救肺汤高、中剂量组ICAM-1 mRNA,p JAK1蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),清燥救肺汤高、中、低剂量组p STAT1蛋白磷酸化显著降低(P<0.01),高、中剂量组效果优于CTX组(P<0.01)。结论:清燥救肺汤能显著抑制荷Lewis小鼠肺癌细胞增殖,其机制可能与降低NF-κB,ICAM-1,p JAK1,EGFR表达及抑制STAT1蛋白磷酸化有关。

基于“蛋白质相互作用网络-分子对接技术-体外实验”三维模式分析青黛对慢性粒细胞白血病的作用机制

目的:在慢性粒细胞白血病(CML)蛋白质相互作用网络构建与分子对接技术指导体外实验模式构建下,探讨青黛干预CML K562细胞的有效分子学机制。方法:使用在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)筛选CML相关基因,String 10.0用于进一步文本挖掘并构建CML可视化蛋白质相互作用网络,将互作数据读入Cytoscape 3.4.0,通过插件Centi Sca Pe 2.1实现网络拓扑分析;青黛活性小分子物质从第三方数据库获取,Chemoffice 8.0与Sybyl 8.1对其再构建、优化,得到青黛小分子配体结构库,通过Surflex-Dock模块与受体靶点进行分子对接,打分后得到关键靶标。随后针对其进行实验验证,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测空白组(无药血清)与试验组(10%,20%和30%含药血清)在24,48,72 h时对K562细胞的增殖抑制率,利用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测两面神激酶(JAK)2蛋白的表达情况。结果:构建了由425个节点(蛋白质)和2 799条边(相互作用)组成的蛋白质相互作用网络,分析得出关键靶标JAK2。研究表明青黛能抑制K562细胞的增殖并能降低JAK2蛋白的表达。结论:CML是一个受多基因调控的复杂疾病,JAK2很可能是其关键节点,而青黛的有效成分靛玉红可通过降低JAK2的表达来干预K562细胞增殖。

制何首乌中大黄素对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型中JAK2/STAT3通路的影响

目的：探讨制何首乌中大黄素抗动脉粥样硬化的作用机制并对两面神激酶2（JAK2）/信号转导及转录激活因子3（STAT3）信号通路及相关因子细胞因子信号传导抑制蛋白3（SOCS3）的影响。方法：雄性Apo E基因敲除（Apo E-/-）小鼠80只,随机均分为8组,分别为大黄素高、中、低剂量组、模型组、阳性药组、阴性组、正常组和大黄素中剂量＋AG490组（DA组）。除正常组,余7组用高脂饲料饲养,并皮下注射脂多糖,9周后停注。第10周开始小鼠给药,6周后处死。酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3及SOCS3的含量,苏木素-伊红（HE）染色检测胸主动脉病理变化,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）法检测肝脏JAK2,STAT3,SOCS3 mRNA的表达。结果：与模型组比较,大黄素高、中剂量组SOCS3含量显著增加,p-JAK2,p-STAT3含量显著减少（P〈0.01）,低剂量组SOCS3含量明显增加（P〈0.05）;JAK2,STAT3无变化;各指标DA组效果不如中剂量组且两组间存在明显差异（P〈0.01）,但STAT3相对表达量中剂量组与DA组有差异（P〈0.05）;各组SOCS3 mRNA表达明显增加,JAK2,STAT3 mRNA表达明显降低（P〈0.05,P〈0.01）。HE染色切片镜下观察,大黄素高、中剂量能有效延缓动脉粥样硬化斑块形成,而低剂量的效果不明显。结论：大黄素能明显作用于Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化病变的发生发展,该作用机制可能与其抑制JAK2/STAT3信号通路有关。

自身免疫性疾病:胞内信号通路及相关靶向治疗药物

细胞因子调控人体免疫应答,在自身免疫性疾病治疗中发挥了重要作用。以细胞因子为靶标的一系列生物制剂在自身免疫性疾病的治疗中取得了前所未有的成功,但并未很好地满足疾病治疗需求。寻找新型治疗手段仍是自身免疫病治疗领域的迫切需求。细胞因子通过调控下游胞内信号通路如两面神激酶(Januskinase,JAK)及信号转导和转录激活因子(signaltransducerandactivatoroftranscription,STAT)通路等发挥信号转导功能。对胞内通路的抑制可以实现对细胞因子的阻断作用从而治疗疾病,JAK抑制剂已被证实对类风湿性关节炎及其他炎症类疾病有效,STAT通路也被认为是未来类风湿性关节炎治疗的一个热点方向。靶向胞内通路已为未来自身免疫性疾病治疗提供了新的思路。结合文献信息及数据库,对目前靶向胞内JAK和STAT信号通路的自身免疫性疾病治疗药物的研发现状进行简要介绍。