氯化两面针碱促进骨髓瘤细胞凋亡的机制研究

目的探究氯化两面针碱促进骨髓瘤细胞凋亡的机制。方法将人多发性骨髓瘤(MM)细胞株RPMI 8226培养至对数生长期,采用CCK-8法检测细胞活性并测定半数抑制浓度(IC_(50))。将MM细胞株RPMI8226随机分为空白组、硼替佐米(BTZ)组、氯化两面针碱(NCe)组和BTZ+NCe组。BTZ组加入500μL10 nmol/L BTZ溶液,参照IC_(50)在NCe组加入500μL 4.5μmol/L NCe,BTZ+NCe组加入250μL 10 nmol/L BTZ和250μL 4.5μmol/L NCe,继续培养24 h。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,实时荧光定量聚合酶链反应、Western blotting检测各组细胞STK4、YAP1、Cl-caspase-3 mRNA和蛋白的表达。结果与空白孔相比,其余各孔的细胞存活率均降低(P<0.05);与0μmol/L NCe孔比较,1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L NCe孔的细胞存活率均降低(P<0.05)。孵育24 h的IC_(50)为(4.56±0.64)μmol/L。与空白组比较,BTZ组、NCe组及BTZ+NCe组细胞凋亡率升高(P<0.05)。与空白组比较,BTZ组、NCe组及BTZ+NCe组STK4 mRNA和蛋白相对表达量降低(P<0.05),YAP1和Cl-caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量升高(P<0.05)。结论氯化两面针碱可以抑制骨髓瘤细胞增殖,促进其凋亡,该作用可能通过抑制STK4/YAP1通路来实现。

氯化两面针碱对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的探讨氯化两面针碱(nitidine chloride,NC)对胶质瘤LN18细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法以胶质瘤LN18细胞为研究对象。实验分为:对照组和NC处理组。采用CCK-8法检测胶质瘤细胞的增殖情况;用划痕和Transwell小室实验检测胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。结果与对照组相比,NC处理组胶质瘤细胞增殖能力与对照组有显著差异(P<0.01),NC处理组胶质瘤细胞的迁移能力低于对照组胶质瘤细胞(P<0.01),NC处理组胶质瘤细胞的侵袭能力低于对照组胶质瘤细胞(P<0.01)。结论氯化两面针碱可以抑制胶质瘤细胞的增殖,降低其迁移及侵袭能力。

氯化两面针碱通过抑制p53泛素化降解诱导宫颈癌细胞凋亡的机制

目的探究氯化两面针碱(nitidine chloride,NC)对宫颈癌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法以宫颈癌细胞系HeLa及SiHa为对象,通过CCK-8法和克隆形成实验检测NC的细胞毒性作用及对细胞生长的抑制作用。通过TUNEL法检测NC对宫颈癌细胞凋亡的影响,并采用Western blot法检测凋亡相关蛋白表达情况。运用免疫共沉淀实验、泛素化实验及Western blot实验分析NC对宫颈癌细胞中p53与E6AP蛋白相互作用、p53泛素化修饰水平、p53蛋白稳定性的影响。结果NC可明显抑制宫颈癌细胞增殖、诱导宫颈癌细胞凋亡,可抑制宫颈癌细胞中抑癌蛋白p53与泛素蛋白连接酶E6AP相互作用,降低p53泛素化修饰水平,延缓p53降解,增加p53蛋白表达水平。结论NC可通过抑制p53泛素化降解,提升p53蛋白表达水平,恢复其抑癌功能,发挥抗宫颈癌作用。

薄层-紫外分光光度法测定两面针中氯化两面针碱的含量

两面针为我国南方地区常用中药,具有活血、行气、祛风、止痛和消肿的功能。用于风寒湿痺引起的胃痛、腹痛、跌打损伤所致的疼痛。近代因发现两面针具有良好的镇痛和抗癌作用,渐被广泛应用。我们用TLC-UV法测定两面针中氯化两面针碱的含量,为两面针药材及其产品的质量控制提供了科学依据。

氯化两面针碱诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的研究

目的研究氯化两面针碱诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的作用。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法检测人肝癌细胞SMMC-7721生长活力;Hoechst33258核染色,观察细胞形态学变化;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率。结果氯化两面针碱作用于细胞后,在体外呈浓度、时间依赖性显著抑制SMMC-7721细胞的生长,作用24、48、72h的半数抑制浓度(IC50)分别为(19.5±1.8)、(3.8±0.2)、(2.8±0.1)mg/L;Hoechst33258染色后,可见核染色质凝集,凋亡细胞呈致密浓染,与对照组相比,氯化两面针碱处理后凋亡细胞比例增加;流式细胞仪检测到G2/M细胞比例增加,G0/G1、S期细胞比例下降。药物作用于SMMC-7721细胞后,随浓度增加细胞凋亡率增加。结论氯化两面针碱对SMMC-7721细胞有明显的生长抑制作用,可能与改变细胞周期并诱导细胞凋亡有关。

HPLC法测定两面针中氯化两面针碱的含量

建立了两面针中氯化两面针碱的HPLC测定法，方法简便、准确。加样回收率为97.7％，RSD＝0．82％，最低检测浓度0．8μg／mL，可用于两面针的质量控制。

氯化两面针碱体外诱导两种鼻咽癌株的细胞凋亡

目的研究氯化两面针碱体外促进两种鼻咽癌细胞株凋亡的作用。方法应用MTT法检测细胞的增殖活性,DNA ladder检测、细胞形态学观察、酶联免疫法进行检测分析。结果氯化两面针碱对两种鼻咽癌7111,Ecv2细胞株的IC50分别为1.238±0.09、1.641±0.331μg.ml-1。在其作用下,两种鼻咽癌细胞株出现典型的凋亡特征,琼脂糖电泳出现典型的DNA梯带,细胞形态学表现出细胞核裂解、染色质聚集、核碎裂,胞浆浓缩、有空泡形成,ELISA法检测样本活性后发现药物作用后细胞中Caspase-3含量明显高于对照组(P<0.05)。结论氯化两面针碱有促进两种鼻咽癌7111,Ecv2细胞株凋亡的作用。

氯化两面针碱体外和体内的抗肿瘤作用

目的观察氯化两面针碱(NC)的抗肿瘤作用。方法采用MTT法观察NC体外对肿瘤细胞存活的影响。移植性S180肉瘤模型小鼠,ip给予NC,每天1次,共10d,测瘤重,计算抑瘤率,并在电镜下观察移植瘤细胞的超微结构。腹水型H22肝癌模型小鼠,sc给予NC,每天1次,共10d,观察小鼠的存活时间,计算生命延长率。结果体外给予NC0.625,1.25,2.5,5.0和10.0mg·L-1可浓度依赖性地降低人鼻咽癌细胞CNE1、人肺癌细胞SPC-A-1和人乳腺癌细胞MDA-MB-231等9种肿瘤细胞的存活率,作用48h平均IC50为(3.33±0.28)mg·L-1。体内给予NC2.5,5.0和10.0mg·kg-1对小鼠S180肉瘤的抑瘤率分别为1.95%,27.3%和42.9%,对腹水型H22肝癌小鼠的生命延长率分别为35.7%,71.4%和85.7%。电镜下可见NC10.0mg·kg-1组S180移植瘤细胞核染色质浓缩并边缘化,核碎裂,胞浆空泡化明显。结论NC体内外应用均具有明显的抗肿瘤作用。

不同部位两面针药材中两面针碱的含量测定

目的:测定两面针药材各部位的两面针碱含量 。方法:采用高效液相色谱法,色谱柱为HYPERSIL BDSC_(18)5μm(4.6mm×250mm),流动相为0.02mol/L磷酸二氢钾-乙腈(66∶34),检测波长为328nm。结果:两面针碱的平均加样回收率和RSD分别为100.24％,1.83％。根中的两面针碱含量最高。结论:本方法可用于两面针的质量控制,根为合理用药部位。

氯化两面针碱体外诱导人口腔鳞癌KB细胞G_2/M期阻滞及凋亡的研究

目的探讨氯化两面针碱对人口腔鳞癌KB细胞周期和凋亡的影响及相互关系。方法应用MTT比色法测定氯化两面针碱对细胞增殖的抑制作用;流式细胞术(FCM)检测氯化两面针碱对细胞周期的影响;Hoechst33258检测细胞凋亡;透射电镜观察细胞超微结构。结果氯化两面针碱在体外呈浓度依赖性显著抑制KB细胞的生长,48hIC_(50)为(2.36±0.22)μg/ml;与空白组相比,经3μg/ml氯化两面针碱作用,G_2/M期细胞比例显著增多;6μg/ml时凋亡细胞比例最高,可见典型的核染色质凝集、碎裂;9μg/ml时,细胞凋亡率明显下降,同时镜下可见大量坏死细胞。结论氯化两面针碱抗KB细胞的方式与其剂量密切相关,低浓度时以G_2/M期阻滞为主,中浓度时诱导凋亡,高浓度时则致其坏死。

氯化两面针碱对斑马鱼胚胎心脏影响的初步研究

目的观察不同浓度的氯化两面针碱对斑马鱼心脏的影响。方法用发育正常的受精后48 h(48 hpf)的斑马鱼胚胎作为实验模型,用浓度为5.00 mg/L、3.15 mg/L、2.00 mg/L、1.58 mg/L、1.12 mg/L的氯化两面针碱处理上述胚胎,分别于受精后60 h和72 h时观察胚胎心脏的形态及心率的变化。结果各给药组在受精后60 h和72 h时均出现胚胎心脏中毒现象。5.00 mg/L、3.15 mg/L实验组中,胚胎主要表现为心脏跳动停止、心脏区域出血,2.00 mg/L、1.58 mg/L、1.12 mg/L实验组的胚胎则主要表现为心脏发育畸形。心率随着浓度的升高而明显下降,随着暴露时间的延长,心率下降不明显。结论氯化两面针碱对斑马鱼胚胎有心脏毒性。

氯化两面针碱对KB及KBV200细胞周期的影响及其机制

目的:研究氯化两面针碱抑制人口腔鳞癌细胞KB及其耐药株KBV200增殖的作用及机制。方法:应用MTT比色法测定氯化两面针碱对细胞增殖的抑制作用;流式细胞术(FCM)检测氯化两面针碱对细胞周期的影响;RT-PCR技术和免疫细胞化学法检测cdc2和cyclinB1的mRNA水平及其蛋白表达。结果:氯化两面针碱在体外呈浓度依赖性显著抑制KB及KBV200细胞的生长,48hIC50分别为(2.36±0.22)mg/L和(2.43±0.19)mg/L;与对照组相比,经3mg/L氯化两面针碱作用,KB及KBV200G0/G1期、S期细胞明显减少,G2/M期细胞显著增多(P<0.01);cyclinB1的转录与表达降低(P<0.01),而cdc2的转录与表达未见明显变化(P>0.05)。结论:氯化两面针碱有可能通过下调cyclinB1的转录与表达来诱导KB细胞及其耐药株KBV200的G2/M期阻滞,从而抑制其增殖。

氯化两面针碱的抗肝癌活性及对DNA拓扑异构酶的影响

目的研究氯化两面针碱对肝癌HepG2裸小鼠移植瘤的抗肿瘤作用及对DNA拓扑异构酶(TOPO)活性的影响。方法建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察氯化两面针碱的肿瘤抑制作用。以pBR322DNA为底物,采用琼脂糖凝胶电泳检测氯化两面针碱对TOPO介导的pBR322 DNA解旋反应的影响,以及对pBR322 DNA是否具有直接断裂作用。结果氯化两面针碱2.5、5和10mg·kg-1剂量对肝癌HepG2的抑制率分别为12.06%、35.63%和60.91%,氯化两面针碱在6.25μmol·L-1时可完全抑制TopoI的催化活性,在25μmol·L-1时完全抑制TopoⅡ的催化活性。结论氯化两面针碱具有较为明显的抗肝癌活性,对DNA TOPO活性的抑制可能是其作用机制之一。

氯化两面针碱对人骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用及其机制

目的探讨氯化两面针碱对人骨肉瘤MG-63细胞诱导凋亡作用及其相关机制。方法将不同浓度的氯化两面针碱作用于MG-63细胞,采用MTT法检测其增殖抑制作用;利用荧光显微镜和电镜观察其对细胞形态的影响;利用流式细胞仪检测不同浓度的氯化两面针碱诱导MG-63细胞的凋亡率;Western blotting法分析caspase-3、caspase-9、Bcl-2和Bax表达的变化。结果 MTT结果表明,氯化两面针碱可明显抑制MG-63细胞的增殖,并存在时间-剂量依赖性。荧光显微镜下,氯化两面针碱处理过的细胞呈现典型的凋亡形态,如细胞核清亮,大小不一,有的裂解成亮蓝色的颗粒。透射电镜下,同样可看到细胞凋亡现象,如胞质内出现大量空泡,细胞核边集,细胞表面微绒毛减少。流式细胞仪结果表明氯化两面针碱诱导细胞凋亡呈明显的剂量依赖性,随着药物浓度升高,凋亡率升高。Western blotting证实,氯化两面针碱能上调MG-63细胞中cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9和Bax的表达,同时下调pro-caspase-3、pro-caspase-9和Bcl-2的表达。结论氯化两面针碱可诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡,其具体机制可能与激活caspase凋亡通路有关。

氯化两面针碱人血浆蛋白结合率的测定

目的建立测定人血浆中氯化两面针碱的高效液相色谱法,并研究氯化两面针碱与人血浆蛋白的结合情况。方法离子对试剂萃取技术对样品进行预处理,乙腈-0.15%磷酸(36:64,V:V,用三乙胺调pH值至3.5)为流动相,C_(18)柱(250mm×4.6mm,5μm)为固定相,紫外检测波长271nm,以氯霉素为内标,采用平衡透析法对氯化两面针碱的人血浆蛋白结合率进行测定。结果氯化两面针碱与内标完全分离,样品中其他成份无干扰,在0.03188～2.040mg·L^(-1)范围内线性关系良好,低、中、高3种不同质量浓度的方法回收率>95%,日内、日间精密度均符合方法学要求。低、中、高3种药物浓度的血浆蛋白结合率分别为68.9%、67.4%、67.9%。结论方法简便、快速,结果准确、可靠,能满足生物样品分析要求。氯化两面针碱具有中等强度的蛋白结合率,蛋白结合率与透析液的药物浓度无关。

氯化两面针碱对肝、肾的毒性及酸性成纤维细胞生长因子对其的保护作用研究

目的:观察氯化两面针碱在体外对人胚肝细胞L-02,人胚肾细胞293的毒性作用,及酸性成纤维细胞生长因子(aF-GF)对氯化两面针碱引起的肝、肾细胞损伤的保护作用。方法:采用MTT法检测不同浓度氯化两面针碱对人肝、肾细胞的毒性,及加入aFGF后对肝、肾细胞的IC50值的影响。采用紫外分光光度法测定培养上清液中的SOD、MDA、LDH值。结果:aFGF可明显提高人胚肝细胞L-02、人胚肾细胞293的IC50值。aFGF保护组与氯化两面针碱损伤组的SOD、MDA和LDH测定结果有显著性差异(P<0.05)。结论:氯化两面针碱对人胚肝细胞L-02和人胚肾细胞293有一定毒性,加入aFGF后,可明显减轻氯化两面针碱对人胚肝细胞L-02和人胚肾细胞293的毒性作用。