细菌的严谨反应研究进展

从严谨反应的发生及其分子机制,严谨反应影响的生理活动等进行了介绍,并以重要病原菌单增李斯特菌、链球菌等为例,阐述了严谨反应对细菌生长、代谢、致病性等的调控作用。以期为解析病原菌的环境适应与致病机制及开发新型药物靶标提供帮助。

“严谨反应”还是“严紧反应”?

“Stringent response”是指细菌在遭受营养饥饿与环境胁迫时,由代谢酶RelA/SpoT催化合成信号分子鸟苷四/五磷酸[(p)ppGpp],从而诱导细菌细胞关闭rRNA、tRNA及核糖体蛋白基因转录,停止多种蛋白质的翻译,严控大部分代谢活动的一系列适应性基因表达过程。“Stringent response”几乎是所有细菌应对逆境的重要调节机制。目前,国内文献对“stringent response”的中文翻译存在“严谨反应”和“严紧反应”混用的现象。基于此,本文对“stringent response”的调控机制、生理功能及字面含义进行了分析,认为“stringent response”翻译为“严紧反应”更为合理、准确。

大肠埃希菌严谨反应蛋白RelA的表达载体构建及生物信息学分析

目的构建大肠埃希菌严谨反应蛋白编码基因relA的原核表达载体,通过生物信息学方法分析RelA蛋白的结构和功能,为阐明RelA介导细菌严谨反应的分子机制奠定基础。方法利用分子克隆技术得到relA的CDS序列,利用基因工程手段将CDS序列连接到原核表达载体pET-22b中,通过抗性基因筛选和双向测序验证,得到重组表达载体pET-22b-relA。采用Protparam、TMHMM、ProtScale ExPASy、PSORTⅡ、SignalP、InterPro、UniProt、NetPhos 3.1、NetNGlyc 1.0、NetOGlyc 4.0、Blast等生物信息学软件和数据库对大肠埃希菌RelA蛋白的理化性质、功能位点、翻译后修饰、三维结构及蛋白相互作用网络等生物学特性进行系统分析;利用Clustal X2和MEGA7.0软件对RelA蛋白进行基于氨基酸序列的同源性分析和系统进化分析。结果成功构建relA基因的原核表达载体pET-22b-relA。生物信息学分析RelA蛋白由744个氨基酸组成,相对分子质量84×103 Da,等电点6.29,有两个卷曲螺旋结构,无跨膜螺旋区,为亲水性蛋白。RelA的N-末端结构域包括PH和SYNTH,C-末端结构域包括TGS、α螺旋区、CC及ACT亚结构域;该蛋白主要在细胞质发挥功能,含有10个NTP结合位点,2个金属离子结合位点,16个合成酶活性位点,53个潜在的磷酸化位点和8个可能的糖基化位点;RelA在细菌之间高度保守,与大肠埃希菌RelA亲缘关系最近的是福氏志贺菌,其次是柯氏柠檬酸杆菌。结论RelA在细菌之间高度保守,提示其在细胞生命活动中具有重要功能,RelA通过与核糖体和tRNA的相互作用介导细菌的严谨反应,因此RelA是一种重要的翻译因子。本研究为全面揭示RelA分子的生物学功能,设计和筛选靶向RelA的新型抗菌药物提供了线索和依据。

大肠杆菌严谨型RNA聚合酶的筛选及体内转录活性测定

利用选择性培养基筛选大肠杆菌自然突变菌株,经噬菌体P1转导和蛋白质互补试验,发现一株突变体(LCH001)的突变基因发生在编码RNA聚合酶β′亚基的rpoC基因上,经DNA序列分析,发现突变位点发生在第3406个碱基上,由G变成了T,导致编码的氨基酸由甘氨酸(GGT)变成半胱氨酸(TGT)。体内转录试验表明该突变RNA聚合酶转录严谨型启动子控制基因的活性显著降低,其β-半乳糖苷酶的活性是野生型菌株的18%,而转录非严谨型启动子控制基因的活性显著提高,其β-半乳糖苷酶的活性约是野生型菌株的5倍。研究结果对探讨RNA聚合酶结构与功能的关系以及RNA聚合酶在细菌严谨反应过程中的作用具有重要意义。

毒素-抗毒素系统介导滞留菌形成机制

滞留菌是一类处于低代谢休眠状态的抗生素耐受细菌亚群,能够在致死性压力应激后存活下来,是抗生素治疗失败和复发性感染的主要原因之一。毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TA)作为压力应激模块普遍存在于各种细菌中,由稳定的毒素和不稳定但可以中和毒素的同源抗毒素组成。压力情况下,第二信使(p)ppGpp激活Lon,随后大多数II型TA系统被激活,诱导滞留菌形成。同样在(p)ppGpp存在的情况下,Obg刺激hokB转录,使毒素积累,抑制细菌DNA复制、转录、翻译等重要的生理过程,驱动细菌形成滞留菌。SOS反应是激活TA系统的另一个主要途径,解除了对tisB转录的抑制,使其在细胞内积累并插入细胞膜,破坏质子动力势,降低胞内ATP水平,诱使休眠和滞留菌形成。讨论TA系统介导滞留菌形成的机制有助于提出新型抗菌策略。

(p)ppGpp——“魔斑”核苷酸在细菌中的研究进展

鸟苷四磷酸(guanosine tetraphosphate,ppGpp)/鸟苷五磷酸(guanosine pentaphosphate,pppGpp)是细菌严谨反应的信号分子,其合成和水解由Rel/SpoT同系物(RelA/SpoT homologue,RSH)家族的蛋白质合成和水解活性控制。(p)ppGpp介导的严谨反应能够提高细菌对营养匮乏的适应能力和抗生素抗性。近年来发现(p)ppGpp与细菌生长和细胞分裂、抗生素合成等都密切相关,是细胞内重要的全局调控因子。(p)ppGpp在细菌细胞中有许多靶点,使其可以调节DNA复制、转录、细胞周期、核糖体生物合成以及抗生素合成基因簇的表达。然而,(p)ppGpp如何控制转录和其他代谢过程取决于细菌种类,并在不同的微生物中通过不同的机制调节相同的过程。因此,本文通过综述(p)ppGpp的合成/水解酶的种类和调节机制,(p)ppGpp对微生物代谢调控机制、对细胞周期的影响机制,以及(p)ppGpp对抗生素合成和耐受性的调控机制,为细菌耐药性研究和细胞生理学研究奠定基础。

信号分子ppGpp与微生物环境适应性

微生物能感知环境胁迫信号,通过触发严谨反应对生长速率进行调节,并通过一系列代谢调控,使细胞能在不利环境中生存。高度磷酸化的鸟苷四/五磷酸ppGpp/pppGpp(文中以ppGpp统称)作为信号分子对微生物生理具有广泛的调节作用,至今仍是微生物学研究热点之一。ppGpp对于微生物适应高温、高压等环境起到了积极的作用。综述了信号分子ppGpp合成降解机制及其调控微生物适应性方面的研究进展。

抗生素耐药性研究进展

抗生素耐药性是当今社会面临的最严峻挑战之一,细菌已经进化出多种机制得以在诸多抗生素中存活。因此,迫切需要寻找新的药物研发途径,理想的药物靶标与代谢和压力相关,而由信号核苷酸(p)pp Gpp调节的严谨反应是有效的靶标之一,抑制该途径会降低致病细菌存活率。最近设计的(p)pp Gpp小分子类似物,在抑制细菌生长和生物膜产生方面取得令人满意的结果。此外,抗菌肽、小RNA和核糖开关以及抗生素佐剂等在耐药性细菌感染方面也有很好的应用前景,本研究对目前抗生素耐药性研究进展加以总结。