角膜缘干细胞缺乏动物模型建立方法研究进展

角膜缘干细胞缺乏(LSCD)是眼科常见疾病,严重的LSCD是角膜病致盲的主要原因之一。LSCD新疗法的探索仍是当今研究的热点。建立LSCD动物模型有助于更深入了解LSCD的发病机制以及评估治疗方法的有效性。目前,LSCD建模的主要方式有机械法、灼烧法、化学法、化学+手术法及基因敲减法。机械法成熟可靠,应用广泛,但可能会引起严重的机械损伤。其中,使用旋转毛刺工具造模损伤均匀且创伤小,但对于工具的使用需要一定的经验积累。灼烧法造模表型稳定,但操作复杂可控性差。化学法造模快速简单,病因与临床病例的吻合度较高,但损伤的深度及范围不可控。化学+手术法角膜表面光滑平整,但易导致角膜中央与角膜缘厚度不一致,影响新生血管生长。基因敲减法复杂且动物饲养困难,应用较少。虽然造模方法众多,但各研究中的造模质量参差不齐。因此,建立可靠、成功率高的LSCD动物模型十分必要。本文就近年来常用LSCD动物模型的建立方法及优缺点进行综述,以期为后续构建合适模型提供借鉴。

人胚胎干细胞来源角膜上皮样细胞用于治疗兔角膜缘干细胞缺乏

目的 通过小分子化合物诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)分化为角膜上皮样细胞,观察角膜上皮样细胞治疗兔角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency, LSCD)的效果。方法 利用拟胚体联合小分子化合物方法,将hESCs H9细胞系向角膜上皮样细胞分化,将角膜上皮样细胞在去上皮羊膜片上培养构建重组细胞膜片。选取造模成功的12只LSCD兔,按照随机数表法分为对照组和实验组,对照组接受去上皮的的羊膜片治疗,实验组接受角膜上皮样细胞膜片移植治疗。术后通过裂隙灯、前节照相等方法,对角膜透明度、新生血管、荧光素钠染色情况进行评分,并于移植后4周观察角膜病理切片结构。结果 成功将hESCs诱导为角膜上皮样细胞,细胞形状和结构类似角膜上皮细胞。病理结果显示,实验组的角膜形成复层上皮结构,上皮下炎症细胞浸润轻,治疗效果明显优于对照组。进行细胞移植治疗后发现,实验组的角膜透明度高、新生血管少,角膜评分明显优于对照组(P<0.05)。诱导后的角膜上皮样细胞的角膜上皮标记物ΔNP63和CK12的表达与hESCs H9相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 采用拟胚体联合小分子化合物可以成功诱导出角膜上皮样细胞,角膜上皮样细胞膜片移植到兔体内后可有效治疗LSCD。

角膜缘微环境细胞的分离培养研究进展

角膜缘微环境细胞(LNCs)是位于角膜缘、与角膜缘上皮干细胞(LESCs)紧密相连的一类间充质干细胞,能同时表达间充质标志物和多种胚胎干细胞标志物,对调节LESCs的静息、自我更新以及分化状态起着重要作用。近年研究表明,LNCs可通过胶原酶消化法、上皮块消化法、中性蛋白酶-胶原酶消化法以及组织块培养法进行体外分离培养,通过3D Matrigel共培养、Transwell共培养可研究LNCs与LESCs之间的相互作用关系。LNCs与LESCs可通过SDF-1/CXCR4、Notch、BMP、Wnt、Sonic Hedgehog、KIT/AKT等多种信号通路以及神经生长因子、角质形成细胞因子、胰岛素样生长因子等多种细胞因子相互作用。LNCs现已成为角膜上皮组织工程、眼表重建以及角膜再生等研究中的一大热点。本文就LNCs的研究背景、体外分离培养方法、与LESCs的相互作用机制及其应用前景等进行综述。

亲属活体角膜缘移植治疗严重角膜缘干细胞缺乏的临床效果

目的观察亲属活体角膜缘移植治疗严重角膜缘干细胞缺乏的临床效果。方法回顾性自身对照研究。纳入同济大学附属同济医院眼科2015年1月至2017年3月因热及化学烧伤造成的严重角膜缘干细胞缺乏13例(17眼),获取适量其直系血亲或亲兄弟姐妹的角膜缘组织移植至受眼,术后随访22~26(24.12±1.31)个月。结果17眼中14眼(82.35%)手术成功。末次随访视力(logMAR,BCVA)为0.7(0.6,1.1),优于术前视力1.8(1.6,2.0)(Z=-3.636,P<0.001),末次随访眼表评分为3(2,4)分,优于术前6(5.5,11.5)分(Z=-3.638,P<0.001)。供眼及受眼均未出现严重的眼部并发症。结论亲属活体角膜缘移植治疗严重角膜缘干细胞缺乏安全、有效。

兔全角膜缘干细胞缺乏模型的构建和鉴定

背景角膜缘干细胞缺乏（LSCD）可导致各种眼表功能异常，严重的LSCD会导致角膜结膜化、慢性炎症、持续的角膜上皮缺失、角膜混浊和伴发的长期视力丧失。目的研究成功构建兔全LSCD模型的适宜方法和最佳时间，观察造模后各时间点模型眼角膜的病理结构改变。方法选择3～5月龄健康日本大耳白兔20只，用手术刀切除左眼360。角膜缘内1mm、角膜缘外2mm的角膜缘上皮组织和剩余的全部中央角膜上皮组织和浅层基质，切除组织厚度为100～150μm。分别在术后2～5周行裂隙灯检查，以角膜混浊、角膜新生血管情况和上皮荧光素钠染色情况为观察指标，按照国际通用LSCD模型评分标准对模型眼进行评分。分别于术后2、3、4、5周获取模型眼的角膜组织标本，行苏木精一伊红染色和过碘酸希夫染色观察角膜组织结构和杯状细胞的改变，用间接免疫荧光染色法检测细胞角蛋白3（CK3）在角膜组织中的表达。手术后不同时间点造模成功率的差异比较采用Fisher精确概率法。结果术后第2、3、4、5周时的模型成功率分别为12．5％、62．5％、81．3％和87．5％，术后第3周造模成功率明显高于第2周，差异有统计学意义（P=0．009）；第3周与第4周相比差异无统计学意义（P=0．465），第3周与第5周相比差异有统计学意义（P=0．049），第4周与第5周相比差异无统计学意义（P=0．200）。造模成功的平均时间为（3．21±0．80）周。造模成功的标准为模型眼角膜明显混浊，角膜新生血管形成和荧光素钠染色阳性。模型眼的组织病理学检查示角膜基质水肿，较多炎性细胞浸润和新生血管形成。过碘酸希夫染色发现，仅在造模后第5周的角膜组织中发现杯状细胞。各时间点造模成功模型眼角膜组织中均未见到CK3阳性表达。结论用手术切除角膜缘及全部中央角膜上皮的方法可以成功构建全LSCD动物模型，造模成功的时间约为手术后3．2周。

角膜缘干细胞缺乏的手术治疗

角膜缘干细胞在角膜上皮更新和创伤愈合中起重要作用。角膜缘干细胞缺乏可导致各种严重眼表面疾患。

角膜缘干细胞缺乏是否可导致归巢因子基质细胞衍生因子1水平变化

背景:如何提高细胞移植的效率,促进来源有限、数量稀缺的角膜缘干细胞走向组织修复的第一步即归巢,是提高移植效率的关键。在视网膜色素上皮细胞的损伤修复中基质细胞衍生因子1可发挥着重要作用。目的:观察大鼠及小鼠眼局部角膜缘干细胞缺乏是否会引起外周血中归巢因子基质细胞衍生因子1质量浓度的变化,以期明确角膜缘干细胞缺乏是否会启动外周血中该因子产生变化,从而吸引外周血干细胞向角膜方向归巢。方法:剖切法制作大鼠和小鼠角膜缘干细胞缺乏模型眼,在为期1个月的观察期内连续抽取外周血,ELISA法检测基质细胞衍生因子1质量浓度。结果与结论:1大鼠外周血基质细胞衍生因子1质量浓度:在建模后24 h即发生变化,呈增长态势,在建模后第3天达到增长峰值,其后逐渐下降,但在第25天又出现1个增长峰值,较第3天的峰值低,其后恢复至正常数值;2小鼠外周血中基质细胞衍生因子1质量浓度:在建模后12 h即发生变化,呈增长态势,在建模后第3天达到增长峰值,其后逐渐下降,但在第20天又出现1个增长峰值,较第3天的峰值低,其后恢复至正常数值;3结果说明:外周血中基质细胞衍生因子1水平与角膜缘干细胞缺乏造成的损伤刺激存在一定关联,可能在干细胞迁移修复角膜损伤中起重要的作用。

翼状胬肉与角膜缘干细胞缺乏的病理研究

目的 研究翼状胬肉的发生与角膜缘干细胞缺乏的相关性。方法 通过对64例翼状胬肉手术病例切除的标本进行病理检查,在镜下观察翼状胬肉颈部组织的上皮细胞和正常角膜缘结膜上皮细胞以及干细胞的移行变化。结果 翼状胬肉头颈部表面上皮细胞层数减少,形态扁平,部分萎缩;翼状胬肉颈部与正常角膜缘球结膜的交界处上皮细胞排列层数逐渐移行减少,基底膜破坏,细胞排列不规则,缺乏基底的柱状细胞(角膜缘基底部柱状细胞包含角膜缘干细胞与短暂扩充细胞)。结论 角膜缘干细胞的缺乏和破坏可能是翼状胬肉发生的重要因素之一。

鉴定角膜缘干细胞缺乏方法的研究进展

角膜缘干细胞缺乏引起的角膜疾病是眼科门诊较为常见的疾病,角膜缘干细胞移植已成为治疗该疾病的研究热点。根据角膜缘干细胞是否缺乏以及角膜缘干细胞的缺乏程度,选择的干细胞治疗方式不同。因此鉴定角膜缘干细胞缺乏是选择移植手术的重要依据,能够为后续移植实验奠定坚实的基础。本文主要总结了近年来鉴定角膜缘干细胞缺乏方法的研究进展。

Wnt信号通路调控角膜缘干细胞治疗角膜缘干细胞缺乏症

背景:Wnt信号通路在干细胞的调控中发挥重要作用,但是其对于角膜缘干细胞的调控作用尚不十分明确。目的:探讨Wnt信号通路对角膜缘干细胞的调控作用及其在角膜缘干细胞缺乏症治疗中的疗效。方法:大鼠角膜缘组织中依次加入Dispase和Trypsin/EDTA进行消化,将消化后的角膜缘干细胞悬液接种于3D-Matrigel微环境中培养,实验组培养体系中加入Wnt信号通路激活剂氯化锂(500μmol/L),对照组不加氯化锂,培养第7天qRT-PCR检测角膜缘干细胞中p63α、CK12、CEBPδ和Ki67的表达,免疫荧光染色检测角膜缘干细胞中β-catenin的表达。采用碱烧伤法建立大鼠角膜缘干细胞缺乏模型,治疗组大鼠结膜下注射激活了Wnt信号通路的角膜缘干细胞,对照组大鼠结膜下注射等量PBS,随后每天使用裂隙灯观察,治疗后第4天取角膜缘组织进行免疫荧光染色、苏木精-伊红染色。结果与结论:①角膜缘干细胞在3D-Matrigel培养微环境中呈球形聚集生长,对照组角膜缘干细胞中β-catenin呈阴性,实验组角膜缘干细胞中β-catenin在细胞浆和细胞核内聚集;②qRT-PCR结果显示:对照组与实验组之间干性指标p63α、CK12和功能指标CEBPδ差异均无显著性意义(P>0.05);实验组增殖指标Ki-67较对照组水平明显升高,差异有显著性意义(P<0.05);③建立大鼠角膜缘干细胞缺乏模型,治疗组大鼠角膜组织混浊评分较对照组明显减低,差异有显著性意义(P<0.05),角膜组织苏木精-伊红染色可见治疗组大鼠角膜上皮细胞排列整齐,细胞大小较均一,修复情况较良好,免疫荧光结果显示治疗组大部分角膜上皮细胞中β-catenin在细胞浆以及细胞核内聚集,而对照组角膜上皮细胞中β-catenin仅是弱阳性,未见在胞浆聚集或者进核;④结果表明,Wnt信号通路的激活增强了角膜缘干细胞的增殖能力,同时能够维持细胞干性,角膜缘干细胞进入干细胞自我更新状态;激活Wnt信号通路后的角膜缘干细胞可促进角膜缘干细胞缺乏模型大鼠角膜上皮的修复,减轻角膜混浊程度;通过调控Wnt信号通路改变角膜缘干细胞的功能特性可能成为治疗角膜缘干细胞缺乏症的新途径。

兔骨髓间充质干细胞在兔角膜缘干细胞完全缺乏模型眼表的分化

目的探讨兔骨髓间充质干细胞(BMSC)移植到兔角膜缘干细胞完全缺乏模型后是否能分化成角膜上皮细胞。方法 3~5月龄清洁级日本大耳白兔24只,采用全周角膜缘板层切除术加中央角膜上皮刮除术建立兔右眼角膜缘干细胞完全缺乏模型,4周后观察眼表形态,行苏木素-伊红(HE)染色、过碘酸-雪夫(PAS)染色及DAPI染色鉴定模型成功与否,选取成功模型18只(36只眼),应用随机数字表法分为对照组(18只兔左眼)、模型组、羊膜组、羊膜加BMSC组,后3组每组6只(兔右眼)。取第三代(P3)兔BMSC,以去上皮羊膜为载体培养观察,待细胞铺满羊膜达90%以上时进行移植手术,于移植术后12周观察兔右眼表形态,行HE染色观察角膜结构,免疫荧光检测兔BMSC分化方向。结果建模后4周有21只兔右眼眼表形态评分达到7分及7分以上,行HE染色、PAS染色、DAPI染色,结果显示角膜缘及角膜上皮细胞层被清除,浅基质层大量炎症细胞浸润及新生血管形成,可见杯状细胞形成,说明模型构建成功。移植术后12周照相观察眼表形态,与自身兔左眼角膜相比,模型组兔右眼角膜混浊,有大量新生血管,羊膜组右眼角膜轻度混浊,有少量新生血管,羊膜加BMSC组兔右眼角膜透明,未见新生血管;HE染色显示羊膜加BMSC组角膜结构修复完整,免疫荧光检测到羊膜加BMSC组有角膜分化的特异性标记因子CK3+12表达,而羊膜组未见表达。结论兔BMSC移植到兔角膜缘干细胞完全缺乏模型后,在体内能够分化成角膜上皮细胞或角膜样上皮细胞,恢复眼表结构及功能。

角膜缘干细胞缺乏的临床诊断及手术治疗进展

角膜缘干细胞缺乏(LSCD)可以与许多眼表及全身免疫系统疾病相关,已成为角膜盲的重要原因之一。过去对LSCD的诊断主要基于病史及临床症状,然而LSCD的临床表现缺乏特异性,甚至根据部分临床表现不足以诊断LSCD。近年来,新开发的眼部成像技术以及分子生物标志物的应用使LSCD的诊断进入了新时代。随着人们对角膜缘上皮干细胞作用的进一步认识以及组织工程领域技术的发展,LSCD的手术治疗方式有了较大进展,在我国角膜供体材料匮乏的情况下,为患者带来了新希望。

角膜缘干细胞缺乏的临床诊疗

许多严重的眼表疾病与角膜缘干细胞缺乏相关:先天性无虹膜症、眼表烧伤、接触镜相关眼病、眼表多次手术、长期局部滴眼剂损伤和各种眼表自身免疫性疾病等都将因角膜缘干细胞缺乏导致角膜结膜化或血管化而致盲。本文对角膜缘干细胞缺乏的诊疗原则作一系统介绍,着重讨论角膜缘干细胞移植术的多种术式和术后处理。

深低温+100%甘油+RPMI1640合成细胞培养液保存羊膜联合角膜缘干细胞移植在眼表重建中的应用

目的:评价深低温+100%甘油+RPMI1640合成细胞培养液保存羊膜联合角膜缘干细胞移植在重建眼表结构中的治疗效果。方法:①实验对象:选取解放军南京军区福州总医院眼科中心2000～2006年收治的严重眼表烧伤患者29例34眼。实验经医学伦理委员会批准,剖腹产孕妇的胎盘由本院妇产科提供,孕妇均签署知情同意书。离体6h以内的同种异体新鲜角膜由福建省红十字会提供。②实验方法:钝性分离羊膜与绒毛膜,将羊膜上皮面朝上平铺于去除胶面的眼科手术薄膜纸片上,剪成3cm×4cm大小,置于100%甘油+RPMI1640合成细胞培养液各5mL的无菌小瓶中,-80℃冷藏备用。在供体眼球角膜缘前1mm处透明角膜上、角膜缘后2mm处巩膜上作适当深度的环形划界,然后剖出带有浅层基质的角膜缘上皮移植片备用。严重眼表烧伤组织,将备好的羊膜植片上皮面朝上平铺于眼表面,依结膜缺损区大小修剪,缝合固定于近角膜缘的浅层巩膜上,使羊膜紧贴于角膜表面,然后将羊膜边缘与球结膜对位缝合。再将备好的角膜缘上皮移植片与植床角膜缘对位固定缝合。此外,4眼伴轻度眼睑闭合不全者同时行眼睑缘粘连性缝合。结果:严重眼表烧伤患者29例34眼中,除眼睑缘粘连性缝合的4眼外,余30眼(88.24%)术后7～14d角膜水肿消退,14～21d上皮修复角膜全表面,结膜表面光滑,无感染发生;术后3～6个月角膜新生血管明显减少,角膜透明度改善,视力提高3～5行;经过22.8个月随访,眼表面稳定。睑缘粘连性缝合的4眼(11.76%)发生羊膜植片急性排斥反应,羊膜融解,改行深板层角膜移植,2个月后观察眼表亦光滑,无睑球粘连发生。结论:深低温+100%甘油+RPMI1640合成细胞培养液保存羊膜联合角膜缘干细胞移植手术,既发挥了羊膜的生物学特性,又提供了角膜缘活性细胞,能快速、稳定促进角膜更新机制的恢复,加速角膜表面重新上皮化,是治疗严重眼表烧伤有效、可行的手术方式。

伴有LADD综合征的角膜缘干细胞缺乏

泪管-耳-牙-指（趾）（LADD）综合征是一种具有多种表现的常染色体显性遗传疾病。最初在1967年由Levy报道。1例双侧泪液系统缺失、杯状耳、干嘴，以及牙、手臂和指（趾）异常的单发病例。之后一些新发现的临床表现，如肾脏异常、唾液腺缺乏、先天性髋脱位、先天性裂孔疝和横膈疝、感觉性耳聋和传导性耳聋、牙发育不全、四肢异常、口腔干燥和眼干都被报道与此综合征有关。

不同诱导剂对体外角膜缘干细胞培养的影响

眼表重建常用的羊膜移植或自体角膜缘干细胞移植的方法,对眼表组织损伤过大,且对眼表自身干细胞缺乏者临床效果较差.我们常采用体外培养自体角膜缘干细胞后联合生物载体进行眼表移植重建.本实验对兔角膜缘干细胞进行体外培养,观察不同的诱导环境对干细胞最终的繁殖分化的影响.

兔健眼角膜缘干细胞取材安全范围的实验研究

目的确定自体角膜缘干细胞移植健眼取材的安全范围,为临床治疗提供实验依据。方法兔眼角膜按30°、60°、90°等依次递增至210°分组切取角膜缘干细胞组织,术后不同时间点裂隙灯下动态观察每组角膜混浊、角膜上皮染色、新生血管3项临床指标,角膜上皮印迹细胞学检查及HE染色观察角膜上皮的细胞表型和病理学改变。结果兔眼角膜缘切取范围大于150°时,出现角膜混浊,上皮持续缺损及新生血管长入,临床指标评分比较,差异有统计学意义(P<0.01)。印迹细胞学检查显示PAS阳性的结膜细胞。组织病理学可见角膜缘上皮细胞层次减少和新生血管。结论自体角膜缘干细胞移植健眼的取材范围≤150°(相当于5个钟点位)是安全的。切取范围>150°时角膜缘干细胞可能出现不可逆的失代偿。印迹细胞学检查是诊断角膜缘干细胞缺乏简单有效的方法。

角膜缘干细胞缺乏影像学诊断的研究进展

角膜缘干细胞缺乏(LSCD)是由于角膜缘干细胞数量或功能异常导致的角膜上皮稳态失衡,其症状缺乏特异性,且裂隙灯检查难以与其他眼表疾病鉴别。印迹细胞学实验室检查只能在一定范围内进行定性诊断。近年来,出现了新型影像学检查,为LSCD的诊断和分期带来了新的曙光。本文归纳总结了多种检查方法,包括眼前节光学相干层析成像术观察角膜上皮厚度和角膜缘Vogt栅栏状结构、眼前节相干光层析血管成像术检测角膜新生血管、角膜活体共聚焦显微镜测量角膜上皮厚度、基底细胞密度和基底膜下神经,以及全场/频域光学相干层析成像术在LSCD诊断方面的应用。旨在为LSCD的临床诊疗及相关研究奠定基础。

翼状胬肉的发生与角膜缘干细胞缺乏的病理研究

目的 :研究翼状胬肉的发生与角膜缘干细胞缺乏的相关性。方法 :通过对 5 4例翼状胬肉手术病例切除的标本进行病理检查 ,在镜下观察翼状胬肉颈部组织的上皮细胞和正常角膜缘结膜上皮细胞以及干细胞的移行变化。结果 :翼状胬肉头颈部表面上皮细胞层数减少 ,形态扁平 ,部分萎缩 ;翼状胬肉颈部与正常角膜缘球结膜的交界处上皮细胞排列层数逐渐移行减少 ,基底膜破坏 ,细胞排列不规则 ,缺乏基底的柱状细胞 (角膜缘基底部柱状细胞包含角膜缘干细胞与短暂扩充细胞 )。结论 :角膜缘干细胞的缺乏和破坏可能是翼状胬肉发生的重要因素之一。