中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子生物活性和理化性质测定

目的：控制中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子产品质量，研究其理化性质及生物学活性的定性和定量。方法：通过离子交换色谱、凝胶过滤及FPLC色谱分高纯化得到中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子，按国家新药审批有关要求对其进行了SDS－PAGE电泳，N端蛋白质序列规定，HPLC色谱分析，UV光谱图谱扫描，并利用PC12细胞培养法和鸡胚背根神经节培养法检测其生物活性。结果：电泳为一条带，亚基分子量为13500，N端蛋白质序列测定后确证为神经生长因子（NGF），HPLC为单峰，相对百分含量为95％以上，279．6nm处呈现出蛋白质样特征吸收峰。生物活性测定为，PC12细胞培养法灵敏度可达1ng／ml，鸡胚背根神经节培养法需30ng／ml的浓度梯度才能在神经节上有所反应。结论：此实验样品为具有较高生物活性的高纯度NGF多肽。

中华眼镜蛇毒神经生长因子的研究

采用ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ和ＳｅｐｈｏｓｉｌＣ８以及ＨＰＬＣ层析方法，自广西产中华眼镜蛇毒中分离纯化神经生长因子（ＮＧＦ），此ＮＧＦ经８ｄ鸡胚背根神经节体外培养证明具有促进神经纤维生长的活性。经ＨＰＬＣ及聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一组成，经ＳＤＳＰＡＧＥ及ＨＰＬＣ测定分子量分别为２４．１ＫＤ和２４．９ＫＤ，等电聚焦电泳测得ｐＩ为８．２，氨基酸组分分析表明ＮＧＦ含酸性氨基酸较少，通过１２５｜标记ＮＧＦ测定出ＮＧＦ在生物体内主要分布于肾、肺。

中华眼镜蛇(Naja Naja Atra)毒神经生长因子对PC_(12)细胞κ阿片受体mRNA表达的影响

目的研究眼镜蛇毒神经生长因子(nNGF)对PC12细胞κ阿片受体mRNA表达的影响,探讨nNGF诱导PC12细胞分化的分子机制。方法用RT-PCR方法半定量地考察nNGF及κ阿片受体的一些拮抗剂和激动剂对PC12细胞κ阿片受体mRNA表达的影响。结果(1)在25,50和100 ng/mL 3个nNGF剂量组中,50和100 ng/mL nNGF显著下调PC12细胞κ阿片受体mRNA的表达。(2)50 ng/mL nNGF分别处理PC12细胞1,3,5,7,10 d后,结果显示κ阿片受体mRNA表达随时间有降低的趋势,7 d时显著下调(P<0.05),10 d时特别显著(P<0.01)。(3)10μmol/L吗啡上调PC12细胞κ阿片受体mRNA表达,并能逆转nNGF对该κ阿片受体mRNA表达的下调效应。10μmol/L纳络酮对PC12细胞κ阿片受体的表达无显著影响,也能逆转nNGF对该κ阿片受体mRNA表达的下调效应。但吗啡和纳络酮共存时不能逆转NGF对该κ阿片受体mRNA表达的下调效应。结论nNGF诱导PC12细胞分化时,能下调其κ阿片受体mRNA表达,这种下调能分别被吗啡或纳络酮逆转,但不能被吗啡和纳络酮共存时逆转。

中华眼镜蛇毒神经生长因子对鸡胚背根神经节及PC1-2细胞作用的观察

目的 采用国际上常用的两种测定神经生长因子活性方法对中华眼镜蛇毒神经生长因子活性作用进行观察。方法 鸡胚背根神经节培养法 ,PC12细胞培养法。结果 鸡胚背根神经节培养法在样品浓度达 5 0ng/ml时有活性反应 ,PC12细胞培养法在定性测定 ,样品浓度为 2 0ng/ml时能观察到活性 ,在用定量测定方法时 ,实验组 ( 5ng/mlNGF)细胞聚团并长出神经状纤维 ,说明有活性。结论 鸡胚背根神经节培养法灵敏度低 ,操作复杂 ,但条件要求简单。PC12细胞培养法灵敏度较高 ,但条件要求也高 ,并且需要有可靠的细胞株。

中华眼镜蛇毒神经生长因子对PC12细胞κ阿片受体蛋白质表达的影响

目的探讨中华眼镜蛇毒(Naja Naja Atra)神经生长因子(nNGF)对PC12细胞κ阿片受体蛋白质表达的影响。方法PC12细胞分为正常对照组和给药组,采用Western blot方法检测各组PC12细胞κ阿片受体蛋白质的表达。结果①nNGF的25、50、100μg.L-13个剂量中,50和100μg.L-1nNGF下调PC12细胞κ阿片受体蛋白质的表达,50μg.L-1剂量组下调最明显(P<0.01),100μg.L-1剂量组下调(P<0.05)。②50μg.L-1nNGF分别处理PC12细胞1、3、5、7、10 d后,其κ阿片受体蛋白质表达呈降低趋势,其中d 5、7下调(P<0.05),d 10下调明显(P<0.01)。③10μmol.L-1吗啡可上调PC12细胞κ阿片受体蛋白表达,而10μmol.L-1纳络酮对其无影响,二者分别都能逆转nNGF的下调效应,但是二者共存时不能逆转nNGF的下调效应。结论nNGF诱导PC12细胞分化中,可引起PC12细胞κ阿片受体蛋白质表达的下调效应,该效应能被吗啡或纳络酮逆转,但二者共存不能被逆转效应。

眼镜蛇毒神经生长因子诱导人鼻咽癌CNE-2细胞凋亡作用的研究

目的:研究广西眼镜蛇毒神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖的抑制作用和诱导细胞凋亡。方法:应用三磷酸腺苷-生物荧光肿瘤化疗药物敏感试验法(ATP-TCA法)测定不同质量浓度(0.0125,0.025,0.05,0.1,0.2g.L-1)NGF处理24,48,72,96h对人鼻咽癌CNE-2生长的抑制率;Hoechst33342荧光染色观察凋亡细胞的形态;琼脂糖凝胶电泳测定DNA断裂状况;流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡率。结果:不同浓度的NGF能抑制CNE-2细胞增殖,并呈浓度-时间效应关系,作用24,48,72,96h的半数抑制浓度(IC50)分别为0.213,0.095,0.048,0.033g.L-1;经NGF(0.1g.L-1)处理细胞48h后,荧光染色呈现典型的细胞凋亡形态学特征;DNA凝胶电泳可见凋亡细胞特有的DNA片段;0.05,0.1,0.2g.L-1NGF作用48h后,CNE-2细胞被阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率分别为(28.2±2.0)%、(39.9±1.9)%、(50.3±1.3)%。结论:NGF通过诱导人鼻咽癌CNE-2细胞凋亡而产生抗鼻咽癌活性。

眼镜蛇毒神经生长因子对成年猫坐骨神经损伤后的作用

目的 探讨从眼镜蛇毒分离纯化出的神经生长因子 (nerve growth factor,NGF)对成年猫坐骨神经损伤后的影响。方法 制成成年猫坐骨神经损伤模型 ,损伤局部注射蛇毒 NGF 2μg/ (kg· d) ,分别治疗 10 d和 30d,并与对照组 (损伤坐骨神经 ,不给药物 )比较。结果 术后 10 d,对照组术侧远端神经纤维数量比治疗组明显减少(P<0 .0 1) ,治疗组术侧足底刺激出现早 ,肢体活动恢复快。术后 30 d,治疗组术侧远端神经纤维大量再生 ,再生神经纤维数量已明显超过对照组和术后 10 d组水平 (P<0 .0 1) ,但结构紊乱 ,轴突和郎氏结消失。术侧肢体在连续注射 NGF 16 d左右出现足底刺激反应消失 ,肢体瘫痪等改变。结论 眼镜蛇毒 NGF在神经损伤早期应用能减轻神经纤维发生的溃变 ,促进受损神经的再生与功能恢复 ;而损伤局部长时间注射蛇毒 NGF则会导致神经纤维增生过度 。

眼镜蛇毒神经生长因子对成年猫坐骨神经损伤治疗效果的实验室观察

目的 :探讨从眼镜蛇毒分离纯化出的神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)对成年猫坐骨经损伤后的影响。方法 :本实验制成成年猫坐骨神经损伤模型 ,损伤局部注射蛇毒NGF(2μg/kg/d) ,分别治疗10d和30d ,并与对照组(损伤坐骨神经 ,不给药物)比较。结果 :眼镜蛇毒NGF在神经损伤早期应用能减轻神经纤维发生的溃变 ,促进神经纤维再生。结论 :损伤局部长时间注射NGF会导致神经纤维增生过度 。

蛇毒神经生长因子的分离纯化及鉴定

采用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０、ＣＭ－Ｃｅｌｕｌｏｓｅ３２柱层析，从中华眼镜蛇中分离出神经生长因子（ＮｅｒｖｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｅｒ，ＮＧＦ）。经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ法证明所得到的ＮＧＦ为单一组分，相对分子质量约为１．３×１０４．经凝胶等电聚焦电泳测得ＮＧＦ等电点ＰＩ约为７．０左右．经ＨＰＬＣ及电泳图像分析系统测得纯度为９８％．此ＮＧＦ经８ｄ鸡胚背根神经节体外培养证明，具有促进神经纤维生长的活性．将所纯化的ＮＧＦ免疫大白兔获得抗血清。

中华眼镜蛇短链神经毒素cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用RT－PCR技术从中华眼镜蛇毒腺组织中成功地克隆了短链神经毒素CDNA。测序结果表明，该基因开放阅读框架编码83个氨基酸残基，其中对个为信号肽，成熟肽为62个氨基酸残基。该基因与GenBank报道的相同物种的神经毒素基因有相当的同源性，不同物种之间的信号肽序列十分保守。将短链神经毒素CDNA再经PCR扩增除去信号肽序列，克隆到pT7ZZ表达质粒中，转化E.coliBL21（DE3）后，经IPTG诱导可高效表达分子量为23kDa②左右的融合蛋白。表达产物占菌体总蛋白的25％左右。

眼镜蛇毒组分抑制人神经胶质瘤U251细胞增殖及其机制研究

目的:探讨眼镜蛇毒组分对人神经胶质瘤U251细胞增殖抑制作用及其机制。方法:采用MTT法比较各种蛇毒组分对U251细胞增殖的抑制效果并筛选出高效组分,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期,激光共聚焦显微镜和电子显微镜观察蛇毒组分作用U251细胞后的形态学变化。结果:11种眼镜蛇毒组分对体外培养的神经胶质瘤细胞U251均有不同程度的生长抑制作用,其中组分KDⅡ-3对肿瘤细f胞的抑制作用呈现剂量和时间依赖性。不同浓度(1、3.75、7.5、15 mg/L)KDⅡ-3作用细胞24 h后,其凋亡率分别为13.3%、17.7%、20.0%、22.4%,且可见到"亚G1期"峰。KDⅡ-3还将U251的细胞周期阻滞在G0/G1期。7.5 mg/L KDⅡ-3作用U251细胞24h后激光共聚焦显微镜观察显示细胞膜皱缩,染色质浓缩、碎裂,透射电镜观察显示细胞核固缩,染色质凝聚。结论:眼镜蛇毒组分KDⅡ-3可抑制神经胶质瘤细胞U251的增殖,促进细胞凋亡。

神经生长因子偶联物对老年性痴呆动物模型的保护作用

目的 探讨神经生长因子偶联物 (NGF -Tf)对老年性痴呆 (AD)大鼠的影响 .方法 以手术切断大鼠双侧隔 -海马胆碱能通路的方法建立AD动物模型 ,每天从大鼠尾静脉注射NGF -Tf .通过水迷路试验观察大鼠的记忆和方向辨别能力 ;对海马和隔区行神经组织学检查 ;应用酶组织化学技术显示相应区域的ChAT ,采用计算机病理图像分析系统测定酶活性以判断其胆碱能功能状态 .结果 水迷路试验中 ,NGF -Tf组在 10s内抵达平台的正确反应平均数提高 (p <0 .0 5 ) .光镜下 ,NGF -Tf组隔区仅见轻微萎缩性改变 ,而模型组隔区萎缩性改变较明显 ,表现为神经元数目明显减少 ,细胞轮廓不清 ,有胶质细胞增生 ;正常对照组、NGF -Tf组和模型组的海马区未见明显病理性改变 .ChAT染色统计结果显示 ,正常对照组、NGF -Tf组大鼠的海马区及隔区IOD值与模型组比较 ,均有显著性差异 (p <0 .0 1) .结论 NGF -Tf能穿透血脑屏障 ,有效防止模拟AD病变的大鼠的基底前脑胆碱能神经元的变性和死亡 ,改善其记忆和方向辨别能力 。

中华眼镜蛇毒组分C与传统化疗药物体外抑制人胶质瘤株作用的对比研究

目的研究中华眼镜蛇毒组分C(FC)体外对人胶质瘤细胞株U251的抑制作用。方法培养箱孵育U251与正常人胶质细胞;加入不同浓度的FC、阿霉素(ADM)和尼莫斯汀(ACNU)。采用细胞毒实验(MTT法),通过细胞生长抑制率评价FC、ACNU和ADM的细胞毒作用。结果FC对胶质瘤细胞的抑制作用突出,24h和48h的IC50分别为2.95μg/ml和2.21μg/ml,而ADM与ACNU远未达到此抑制率。FC对正常胶质细胞的24h、48hIC50分别为8.60μg/ml和6.61μg/ml,两细胞株间存在显著性差异(P<0.05)。结论人胶质瘤细胞对FC的细胞毒性作用是敏感的。FC对胶质瘤细胞的抑制作用优于ADM和ACNU。

神经生长因子偶联物对拟痴呆大鼠的作用

目的 :采用静脉注射神经生长因子偶联物 (NGF- Tf)的方法 ,研究其对痴呆 (AD)大鼠的影响。方法 :选用手术切断大鼠双侧隔——海马胆碱能通路的方法建立 AD动物模型 ,每天从大鼠尾静脉注射 NGF- Tf。分别以跳台试验和水迷路试验观察大鼠的学习记忆以及方向辨别能力 ;并对相应海马和隔区行神经组织学检查。结果 :模型组跳台试验错误次数增加 ,在训练期与正常组比较有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ;NGF- Tf组错误次数较少 ,与模型组比较 ,在训练期差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ,测验期错误次数减少率亦可达 5 0 %。水迷路试验中 ,NGF- Tf组在 1 0 s内抵达平台的正确反应平均数提高 ,与模型组比较 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。光镜下 ,NGF- Tf组隔区仅见轻微萎缩性改变 ,而模型组隔区萎缩性改变较明显 ,表现为神经元数目明显减少 ,细胞轮廓不清 ,有胶质细胞增生。正常对照组、NGF- Tf组和模型组的海马区未见明显病理性改变。结论 :NGF-Tf能穿透血脑屏障 ,有效防止模拟 AD病变的大鼠的基底前脑胆碱能神经元的变性和死亡 ,改善其学习记忆能力 。

眼镜蛇毒NGF通过PI3K/Akt促人肝星状细胞凋亡的机制研究

目的探讨眼镜蛇毒神经生长因子NGF对肝纤维化关键细胞LX2的作用及机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度NGF和LY294002对LX2细胞增殖的影响,流式法检测NGF对LX2细胞凋亡的影响,Western blot法研究NGF和LY294002单用与联用对p-Akt蛋白水平表达的影响。结果NGF可降低LX2细胞存活率,最小有效浓度为1 mg·L^(-1);增加LX2细胞凋亡率;降低p-Akt表达水平,而对Akt的表达水平无明显影响。结论 NGF可通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活,促进LX2细胞凋亡,并有一定的浓度依赖性。本研究对阐明肝纤维化的发病机制,为临床上治疗肝纤维化均有重要意义。

广西眼镜蛇毒神经生长因子分离纯化方法

为了得到更高纯度和活性的广西眼镜蛇毒神经生长因子(never growth factor,NGF),我们对原有的分离纯化方法进行改进。采用DEAE CL-6B离子交换柱、Sephadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S离子交换柱结合的方法进行分离。在分离纯化过程中,采用PC12细胞检验每一步所得结果中的NGF活性,并测定NGF诱导PC12细胞分化的最小浓度。经DEAE CL-6B离子交换柱、Sephadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S离子交换柱分离纯化后,得到的第二峰具有NGF活性,并且已达到电泳纯。经PC12细胞验证后,确定NGF诱导PC12细胞分化的最小浓度为0.1μg/m L。

中华眼镜蛇神经毒素的分离

蛇毒含有多种蛋白质成分,一部分是酶类;还有一部分是具有不同毒理作用的毒素,其中包括神经毒素。它是一类小分子量并且具有突触后作用的硷性蛋白质,作用类似箭毒。

蛇产品市场信息

香港速冻蛇肉市场扩大近年香港进口活蛇有下降趋势,而速冻蛇肉则呈上升趋势。主要原因是供货的来源地中国内地及泰国本国内销增加,活蛇出口减少,同时活蛇运输极不方便,而速冻蛇肉的食味与活蛇没有什么不同,所以速冻蛇肉增加。据悉,去年香港进口活蛇数量达21.4万条,速冻蛇肉约10公斤。