中华硬蜱、越原血蜱和青海血蜱经期传播莱姆病螺旋体的实验研究

以实验室培育的非感染中华硬蜱、越原血蜱和青海血蜱刺叮人工感染 2 1天的阳性KM鼠 ,利用分离培养和PCR方法检测蜱对莱姆病螺旋体Borreliagarinii的保持能力以及体内螺旋体对敏感动物的感染能力。中华硬蜱、越原血蜱和青海血蜱非感染幼蜱均可以通过吸血获得莱姆病螺旋体 ,然而 ,它们在饱血、消化、蜕皮和再次吸血过程中对莱姆病螺旋体的保持能力差异很大。只有中华硬蜱可以保持活的莱姆病螺旋体直至蜕化为下一发育阶段 ,蜕化后仍携带莱姆病螺旋体并对敏感KM鼠有感染能力。而越原血蜱和青海血蜱对莱姆病螺旋体的保持能力不能跨越消化、蜕皮阶段 ,蜕化后这两种血蜱不再携带莱姆病螺旋体 ,因此 ,这两种血蜱不具备经期传播能力 ,作为莱姆病媒介的可能性不大。中华硬蜱于幼蜱到若蜱以及若蜱到成蜱两个阶段均具备经期传播莱姆病螺旋体的能力 。

安徽黄山地区中华硬蜱及其宿主感染莱姆病Borrelia afzelii的检测

利用PCR和病原体分离技术对安徽黄山地区中华硬蜱及其宿主感染莱姆病螺旋体的状况进行了检测，结果从40只黄山林区的中华硬蜱中获得了一株莱姆病螺旋体分离株，寄主动物及其他中华硬蜱均未获得阳性分离结果。以16srRNA为靶标进行PCR检测，6．78％雌性和5％雄性中华硬蜱发现有阳性感染，2只草兔（92只）和1只麂子（16只）也发现有阳性感染；若蜱和其余宿主动物未发现阳性感染。阳性分离株和扩增获得的16srRNA序列结果一致，同GenBank中的B．afielii的系统发育关系最近，提示该分离株螺旋体属于B．afzelii。该结果与前期的实验传播结果提示中华硬蜱是我国南方莱姆病的传播媒介。

中华硬蜱和二棘血蜱的交叉免疫反应

本文首次比较了经中华硬蜱(Ixodes sinensis)叮咬三次后再经二棘血蜱(Haemaphysalisbispinosa)叮咬的家兔与仅经二棘血蜱叮咬的家兔的交叉免疫抗性。二棘血蜱叮咬被中华硬蜱致敏的家兔时,吸血增重为:143.12±32.67mg,但二棘血蜱在正常家兔体上寄生,初次吸血增重为:181.30±44.35mg,两者之间有显著性差异(P<0.01)。中华硬蜱和二棘血蜱唾液腺提取物(SGE)经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),显示两者分别有24条和22条电泳带,中华硬蜱主带有6条,分子量分别为142、105、94、66/65、64和56kD,而二棘血蜱主带有5条,分子量分别为:215、114、105、66/65和58kD,经中华硬蜱叮咬致敏的家兔血清和经二棘血蜱叮咬致敏的家兔血清作免疫印渍,均显示出105kD这一电泳带。该实验表明中华硬蜱和二棘血蜱叮咬家兔两者之间存在着交叉免疫反应,提示105kD蛋白质抗原可能是两者的共同抗原。

中华硬蜱叮刺宿主后免疫相互作用的研究

在实验室条件控制下,中华硬蜱重复叮咬家兔后吸血量明显减少,初次叮咬后吸血增重233.78±44.71mg,第二和第三次叮咬分别下降至67.03±25.18mg和80.23±29.96mg(P<0.001)。被咬后的家兔血清经ELISA测定其体内蜱抗体(OD值0.48)较对照组家兔(OD值0.08)显著高(P<0.01)。免疫后家兔其~3H-TdR淋巴细胞转化试验和皮肤试验与对照组家兔有显著差异,表明家兔对中华硬蜱叮咬所产生的获得住免疫力,包括宿主的体液免疫和细胞免疫。

中华硬蜱初次和再次感染宿主后叮咬局部组织病理学变化的动态观察

中华硬蜱初次叮咬和再次叮咬宿主后 ,叮咬部位可发生一系列程度不同的病理学变化 ,在初次叮咬过程中 ,叮咬局部组织反应较轻 ,其皮肤组织中炎性细胞浸润较少 ,主要为中性粒细胞以及少量巨噬细胞 ,于叮咬后 5 d达高峰 ,无组织坏死现象。而中华硬蜱叮咬再次感染组宿主 6 h,叮咬局部组织反应剧烈 ,呈现急性炎性损伤 ,可出现大量炎性细胞浸润 ,其中含大量嗜碱性粒细胞和部分嗜酸性粒细胞及淋巴细胞 ,嗜碱性粒细胞可出现明显脱颗粒现象。体视学结果显示 ,再次感染组炎症细胞浸润于 1～ 3d达高峰。同时叮咬局部组织出现明显充血、水肿和坏死现象 ,电镜下其皮肤组织结构排列紊乱 ,胶原纤维结构模糊 ,组织中出现大量炎性细胞碎片。

中华硬蜱叮咬免疫接种宿主后中肠病理变化的动态观察

目的为系统观察中华硬蜱成虫叮咬蜱抗原免疫接种组和佐剂对照组宿主后中肠上皮形态学动态变化。方法选用中华硬蜱叮咬唾液腺抗原免疫接种组0兔和佐剂对照组兔，分别在叮咬后24h、48h、72h以及第5、8天电镜下观察中肠上皮形态学变化。结果中华硬蜱叮咬唾液腺抗原免疫接种宿主后，蜱中肠上皮遭到较严重程度的损伤和破坏，消化细胞表面微绒毛减少、变短、排列不整，细胞内粗面内质网扩张，线粒体嵴减少，高铁血红素颗粒及脂滴较对照组明显减少，基底迷路系统空泡化，基膜变性、松散和断裂等。而对照组蜱中肠消化细胞发育正常。讨论结果提示在蜱抗诱导的宿主抗蜱免疫作用中，蜱中肠是主要损伤部位，中肠的病理损伤是蟀吸血、生殖能力变化的病理学基础。

叮咬不同免疫力兔后中华硬蜱中肠上皮细胞超微结构的观察

目的 探讨叮咬不同免疫力兔后中华硬蜱中肠上皮细胞的病理变化。 方法 选用中华硬蜱相对分子质量 (Mr)为 10 5 0 0 0纯化抗原 ,按常规方法分别于后足掌、腹股沟以及颈背部多点皮内注射免疫新西兰兔。免疫后每只兔用 3 0只雌性中华硬蜱成虫叮咬 ,于 2 4h、48h、72h、5d及 8d ,每组各取 3只吸血中华硬蜱观察其中肠上皮细胞超微结构的变化。 结果 中华硬蜱初次叮咬兔后 ,消化细胞随叮咬时间延长而增多增大 ,微绒毛较密集 ,排列整齐 ,胞质内细胞器丰富 ,各单位膜结构清晰 ,并出现顶端小管、小泡、大量脂滴和高铁血红蛋白颗粒 ;近基膜的细胞膜内褶形成发达的基底迷路系统。叮咬经Mr 10 5 0 0 0纯化抗原免疫接种兔后 ,中华硬蜱中肠上皮细胞严重损伤和破坏 ,消化细胞数量与体积较初次叮咬组及佐剂对照组间差异具有显著性意义。叮咬后 2 4～ 48h消化细胞表面微绒毛减少 ,变短、排列不整 ,细胞粗面内质网扩张 ,线粒体嵴减少 ,高铁血红蛋白颗粒及脂滴等均较初次叮咬组和佐剂对照组明显减少 ,基底迷路系统空泡化 ,基膜变性、松散和断裂等。叮咬后 72h～ 8d ,细胞器变性、坏死 ,细胞核固缩、碎裂以及细胞溶解、碎裂等。 结论 中华硬蜱叮咬Mr 10 5 0 0 0的纯化抗原免疫接种新西兰兔 ,能使其产生获得性免疫力。

中华硬蜱叮咬蜱抗原免疫接种宿主后中肠组织化学的动态观察

选用中华硬蜱叮咬中肠抗原免疫接种组及初次叮咬组和佐剂对照组宿主并分别在不同时间(叮咬24、48、72h以及5、8d)对蜱中肠蛋白质、糖原及多糖进行了动态观察,并对消化细胞核DNA含量进行测定。结果显示:蜱叮咬中肠抗原免疫接种宿主后可使中肠上皮发生破坏,消化细胞破损,基膜可出现松散和断裂,消化细胞蛋白质含量较初次叮咬组和佐剂对照组宿主明显降低,而糖原及多糖含量基本不变。消化细胞DNA在叮咬无免疫力宿主(初次叮咬组和佐剂对照组)早期24h主要为2倍体,随着吸血量增加、细胞核倍体数加大,第5天达7.06倍体,而叮咬中肠抗原免疫接种组宿主后,消化细胞细胞核倍体数增加不明显,与叮咬无免疫力宿主有显著性差异(P>0.01),提示中华硬蜱叮咬中肠抗原免疫接种宿主后,可干扰中肠消化细胞蛋白质和核酸(DNA)的合成代谢,为进一步揭示抗蜱免疫机理提供了理论依据。

中华硬蜱特异性抗原的定位

采用LSAB免疫酶组化染色技术 ,对中华硬蜱特异性抗原定位进行分析 ;用中华硬蜱反复叮咬后的动物血清 ,经LSAB法抗原片染色 ;结果显示 :中华硬蜱唾液腺和中肠上皮呈阳性反应 ,而在蜱的肌肉组织、卵巢组织、血腔等器官组织均显阴性反应 ,提示中华硬蜱唾液腺和中肠上皮为特异性抗原所在部位 ,为中华硬蜱进一步抗原纯化。

中华硬蜱叮咬免疫兔后中肠消化细胞形态测量分析

本文采用军事医学科学院生产的多功能系统，对叮咬经不同抗原免疫接种兔后的中华硬蜱中肠消化细胞进行形态学测量分析，以了解蜱中肠受损程度和各种抗原诱导免疫力产生的强弱。结果表明：蜱血餐后其中肠增粗，肠壁增厚：消化细胞数量增加，体积增大；而细胞核相对较小，核体密度、表面积密度变小。中华硬蜱叮咬免疫兔后上述各种吸血后的正常反应不如佐剂对照组，尤以纯化抗原接种组明显，其中肠也增粗，由于大量消化细胞受损伤而脱落，使得消化细胞数减少，由于大量消化细胞受损脱落使消化细胞数减小和消化细胞平均截面面积减小。由于核固缩、核碎裂、核溶解早于细胞碎裂脱落，使细胞核的体密度和表面积密度明显减小。与对照组相比，肠直径、肠壁面积、消化细胞截面数、数面密度、截面面积和消化细胞核的体密度及表面积密度均有显著性或非常显著性差异。受损程度依次为纯化抗原（ＰＡ）组、中肠抗原（ＭＡ）组、唾液腺抗原（ＳＧＡ）组和全虫抗原（ＷＴＡ）组。卵抗原（ＯＡ）组损伤最轻。本实验的五个免疫接种组中有四个组能有效诱导宿主产生免疫力，以１０５ＫＤ纯化抗原接种作用最强。

中华硬蜱TROSPA的发现与鉴定

笔者从我国莱姆病媒介蜱种中华硬蜱中鉴定出莱姆病螺旋体外膜蛋白A受体TROSPA。中华硬蜱幼蜱体内的两个cDNA克隆I．sin-1（258bp）和I．sin-2（462bp）经序列比对和分析属于TROSPA．其中，I．sin-2的氨基酸序列同肩板硬蜱I.scapularis、篦子硬蜱I.ricinus和全沟硬蜱I.persulcatus的相似度分别为88．2％、88．5％和88．8％，而I.sin-1则分别存在46％、46．1％和45．6％的相似度。中华硬蜱TROSPA的发现为解释了中华硬蜱传播莱姆病的机制以及研究中华硬蜱与病原体的相互关系奠定了基础。

二棘血蜱叮咬中华硬蜱纯化抗原免疫接种宿主后的交叉免疫反应

选用中华硬蜱105kD柱层析纯化抗原对新西兰兔进行免疫接种,再用二棘血蜱进行叮咬,并与单纯二棘血蜱叮咬组和佐剂对照组进行对比,以探讨不同种属硬蜱之间的交叉免疫抗性。结果显示:单纯二棘血蜱叮咬组吸血量为181 3±44 3mg,而二棘血蜱叮咬由中华硬蜱105kD纯化抗原免疫接种组和佐剂对照组新西兰兔后其吸血量分别为102 1±25 3mg和168 5±40 9mg,纯化抗原免疫接种组较单纯二棘血蜱叮咬组和佐剂对照组吸血量分别下降43 7%和39 4%(P<0 01)。同时,纯化抗原免疫接种组也较单纯二棘血蜱叮咬组和佐剂对照组产卵量有显著下降。该研究结果表明中华硬蜱和二棘血蜱之间存在着交叉免疫反应。

中华硬蜱叮咬不同免疫力新西兰兔后中肠上皮组织的形态动态变化

通过光镜和电镜观察了中华硬蜱Ixodessinensis叮咬初次和再次感染宿主新西兰兔后不同时间 (叮咬后 2 4h、4 8h、72h以及第 5天、第 8天 )中肠上皮组织的形态学动态变化。结果显示 :中华硬蜱叮咬前中肠上皮主要由替代细胞和少量体积较大的消化细胞构成 ;替代细胞数量多、体积小、呈圆形、胞质染色浅。中华硬蜱叮咬初次感染宿主后 ,消化细胞随叮咬时间延长而增多增大 ,微绒毛较密集 ,排列整齐 ,胞质内细胞器丰富 ,各单位膜结构清晰 ,并出现顶端小管、小泡、大量脂滴和高铁血红素颗粒 ;近基膜的细胞膜内褶形成发达的基底迷路系统。中华硬蜱叮咬再次感染宿主后 ,中肠可发生一系列明显的病理变化 ,中肠基膜出现变薄、松散和断裂现象 ,消化细胞破裂、空泡化 ,消化细胞数量减少 ;消化细胞微绒毛减少、变短、排列不整 ,线粒体肿大 ,体嵴减少、变短甚至髓样变 ,粗面内质网扩张 ,脂粒及高铁血红素颗粒减少 ,细胞膜吞饮、吞噬现象减弱 ,消化细胞内结构紊乱和破坏。该研究结果提示初次叮咬导致了宿主的免疫抗性 。

H_1和H_2组胺受体拮抗剂对中华硬蜱感染宿主的影响

中华硬蜱雌性成虫再次感染家兔后，叮咬局部组织中组胺含量较初次感染显著升高（Ｐ＜０．０１）。为了进一步证实组胺在抗蜱免疫中的作用，本文选用苯海拉明（Ｈ１组胺受体拮抗剂）、盐酸雷尼替丁（Ｈ２组胺受体拮抗剂）给再次感染组家兔灌胃，观察使用组胺拮抗剂对中华硬蜱吸血、生殖能力的影响。结果显示：单独给予Ｈ１或Ｈ２受体拮抗剂不改变家兔获得性抵抗力，但同时给予Ｈ１和Ｈ２受体拮抗剂则可明显降低家兔的抗蜱免疫反应，从而使中华硬蜱吸血量、吸血时间、产卵量等较再次叮咬组家兔有显著变化（Ｐ＜０．０１）。

中华硬蜱幼虫的形态(蜱螨亚纲:硬蜱科)

中华硬蜱Ixodes sinensis Teng系邓国藩(1977)所建立。以前文献中将此种误订为蓖子硬蜱I.ricinus或全沟硬蜱 I.persulcatus。作者用光学显微镜和扫描电镜详细观察了中华硬蜱幼虫的形态,发现它与蓖子硬蜱和全沟硬蜱的幼虫有明显差别。

中华硬蜱再次叮咬宿主后中肠消化细胞的形态测量学研究

本文用图像分析仪对初次和再次叮咬宿主兔后的中华硬蜱中肠消化细胞进行了ＤＮＡ和形态测量学分析。结果表明；蜱血餐后其中肠消化细胞ＤＮＡ增加，约第５天达高峰。初次叮咬组吸血后ＤＮＡ倍体数增加显著，第五天ＤＮＡ平均倍体数达７０６，峰值达１２Ｃ，≥５Ｃ细胞达４４２％。且随叮咬吸血时间延长，中肠增粗，直径增大；肠壁增厚，肠壁横截面面积增大；消化细胞增多，消化细胞截面数增加；消化细胞增大，消化细胞平均截面面积增大；而消化细胞数面密度下降，消化细胞核的体密度和表面积密度下降。这些结果均是对吸入血液进行消化和储存营养物质的正常反应。当中华硬蜱叮咬经初次感染后的宿主兔时，ＤＮＡ倍体数、横切面肠壁面积、消化细胞截面数、消化细胞平均截面面积等增加的幅度不如初次叮咬组，而消化细胞核的体密度和表面积密度下降更显著，提示由于初次叮咬使宿主产生了较强的免疫力而使中肠消化细胞破坏、脱落或抑制增殖而出现吸血量下降。

中华硬蜱叮咬免疫兔后中肠消化细胞DNA图像分析

本文用图像分析仪对叮咬经不同抗原免疫接种兔后的中华硬蜱中肠消化细胞ＤＮＡ进行测量分析。结果表明：蜱血餐后其中肠消化细胞ＤＮＡ增加，约第５天达高峰。佐剂对照组吸血后蜱消化细胞ＤＮＡ倍体数显著增大，第５天ＤＮＡ平均倍体数可达６８Ｃ，峰值达１１８Ｃ，≥５Ｃ细胞达３４％。５天后所有消化细胞均≥５Ｃ。中华硬蜱叮咬不同抗原免疫接种兔后中肠消化细胞ＤＮＡ量血餐后不能有效地增加。影响程度依次为柱层析１０５ＫＤ纯化抗原组、中肠抗原组、唾液腺抗原组、全虫抗原组和卵抗原接种组。除卵抗原组外，其它各免疫组平均ＤＮＡ均＜５Ｃ，≥５Ｃ的细胞数＜１７％，峰值＜７Ｃ，且各时期均可见数量不等的２Ｃ和３－４Ｃ细胞，与对照组比较均有显著性差异（Ｐ＜００５）。上述结果提示相关的抗原免疫接种宿主后，可使宿主产生获得性免疫力，导致中华硬蜱吸血后中肠消化细胞ＤＮＡ在血液消化过程中的正常增加受到严重影响，其机理可能与ＤＮＡ合成受阻及消化细胞破坏有关。本实验的五个免疫接种组中以纯化抗原接种组作用最强，在选择制作抗蜱疫苗时可供参考。

宿主被中华硬蜱叮咬后局部皮肤组织病理学研究

用光镜、电镜和体视学方法观察和分析经不同抗原免疫接种兔被蜱叮咬的局部组织病理变化,以了解局部组织的反应性。结果表明佐剂对照组、纯化抗原组和唾液腺抗原组兔被叮咬后均出现炎症变化,佐剂对照组和纯化抗原组反应较轻,唾液腺抗原组反应较重;佐剂对照组主要为中性粒细胞浸润;免疫接种组主要为嗜碱性细胞浸润,并可见脱颗粒现象。局部组织细胞数密度纯化抗原组显著低于唾液腺抗原组,提示纯化抗原接种既可诱导宿主产生较强的获得性免疫力,局部反应又较轻,是抗蜱疫苗主要候选抗原之一。

中华硬蜱凝血酶抑制剂的分离纯化与活性

通过凝胶过滤和反相高压液相层析,从200只半饱吸血的中华硬蜱(Ixodidesinesis)唾液腺中分离纯化得到一凝血酶抑制剂。用飞行质谱测定其分子量为6·356kDa,与其他蜱类来源的凝血酶抑制剂分子量不同,提示为一新蛋白分子。该抑制剂对凝血酶有强烈的抑制活性,对激活的第X因子和胰蛋白酶有微弱的抑制活性。其发现将为发展疫苗、生物控制中华硬蜱提供资料和目标抗原。

中华硬蜱全虫可溶性抗原对家兔免疫保护作用的研究

选用中华硬蜱（Ixodes sinensis)雌性全虫可溶性抗原对家兔进行了人工免疫接种，在按常规方法免疫接种三次后，用中华硬蜱成虫进行感染（叮咬），分别观察全虫抗原接种组，佐剂和空白对照组中华硬蜱的吸血、生殖情况，结果显示，中华硬叮咬全虫抗原免疫接种兔后其吸血量，产卵量均较对照组显著降低，蜱的吸血量较佐剂和空白对照分别下降19．02％和31．52％，中华硬蜱产卵前时间延长，并且产卵量和产卵量指数降低，并对蜱抗原免疫接种诱导宿生产生特异性抵抗力进行了分析讨论。