基于PCR的中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测技术研究进展

中华蜜蜂囊状幼虫病毒是中华蜜蜂囊状幼虫病的病原,属单正链小RNA病毒,是危害中华蜜蜂最主要的病毒之一。快速、高效、特异性强、灵敏度高的检测方式对遇制中华蜜蜂囊状幼虫病的发生与传播非常重要。对常用的基于PCR的中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测方法进行了综述,并对它们的优缺点进行了比较,以期为中华蜜蜂囊状幼虫病毒的检测方法提供参考。

中华蜜蜂幼虫原代细胞培养及中华蜜蜂囊状幼虫病毒在培养的细胞中的复制

【目的】建立一种适用于蜜蜂源的细胞培养方法,为蜜蜂源细胞培养和蜂病毒的研究奠定基础。【方法】比较在Grace和WH2两种昆虫细胞培养基中培养的中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫原代细胞状况,筛选出适用于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养的最佳培养基,并通过细胞活力比较,确定用于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养的适宜胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）浓度。在此基础上,用该原代细胞接种中华蜜蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood bee disease,CSBV）,并通过实时定量RT-PCR方法对病毒复制情况进行检测。【结果】相对于WH2培养基,在Grace培养基中生长的细胞大而圆,透明,边缘整齐,无颗粒物,活力明显高于WH2培养,且含15%FBS的Grace培养基更适合于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养。CSBV接种在该原代细胞,能够复制增殖,同时伴随宿主细胞快速分裂。【结论】中华蜜蜂幼虫原代细胞培养基在含15%FBS的Grace中能够良好生长,并且CSBV可以在该原代细胞中进行复制。

中华蜜蜂囊状幼虫病毒北京分离株VP1蛋白基因序列特征及原核表达

【目的】研究中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)VP1蛋白的分子进化特征及遗传多样性。【方法】利用RT-PCR方法,克隆了8株CSBV北京分离株VP1蛋白的基因编码区。【结果】序列分析表明,VP1蛋白基因编码区开放阅读框长945 bp,编码315个氨基酸,推测编码蛋白的相对分子量和等电点分别为35.42 kDa和9.23,具有亲水性和免疫原性。序列同源性分析表明,不同年份CSBV北京分离株VP1蛋白氨基酸序列间差异较小,仅个别氨基酸存在差异。北京分离株与辽宁分离株及越南分离株VP1核苷酸序列一致性达93%,与印度及韩国分离株VP1核苷酸序列一致性达92%,与英国分离株VP1核苷酸序列一致性最低,为88%。序列分析同时表明,CSBV北京分离株VP1蛋白序列存在特有的序列特征,同其他地区分离株比较,北京分离株VP1蛋白序列中存在着氨基酸的插入突变。序列替换率分析表明,亚洲型分离株间序列替换率低于亚洲分离株与欧洲分离株间的替换率。构建原核表达载体pEASY-E1-VP1,经IPTG诱导,CSBV VP1蛋白在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)pLysS菌株中表达。【结论】本研究提示CSBV不同分离株基因序列存在变异,结果为进一步研究CSBV致病性分化的分子机理奠定了基础。

浙江省淳安县中华蜜蜂囊状幼虫病毒与蜂房球菌感染情况调查

为了解浙江省淳安县中华蜜蜂囊状幼虫病和欧洲幼虫腐臭病病原[中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)和蜂房球菌(Melissococcus pluton)]全年流行情况,于2019年1月—12月采集淳安县5个饲养点的中蜂工蜂,并采用聚合酶链式反应检测方法,监测这2种病原在蜂群内的动态变化情况。结果显示:CSBV蜂群感染率在春季3月最高,为84%,到夏季7月降到最低,又从秋季开始升高,一直延续到冬季;蜂房球菌感染率从春季开始升高,到夏季开始下降,又从秋季开始升高,在10月和11月达到全年最高水平,为72%,冬季略有下降;在一年当中,蜂群内中蜂囊状幼虫病和欧洲幼虫腐臭病病原具有共同存在的现象;通过实时荧光定量聚合酶链式反应检测发现,秋季蜂房球菌存在的蜂群内CSBV载量显著高于单一检出CSBV的蜂群(P<0.05)。总之,本研究明确了浙江省淳安县中蜂2种主要病原在蜂群中的全年流行动态情况,可为该地区中蜂病害的预防和控制提供理论指导。

中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测方法研究进展

中蜂囊状幼虫病是一种由中蜂囊状幼虫病毒引起的严重威胁中蜂健康的传染性疾病。目前由于该病尚无有效的药物治疗方式,因此,预防与及时检测对于遏制该病传播显得尤为重要。本文主要从临床诊断、分子生物学和免疫学方面总结中蜂囊状幼虫病检测与鉴定的方法,包括形态诊断、RT-PCR技术、实时荧光定量PCR、巢式PCR、胶体金免疫快速诊断技术、ELISA、血清学技术和基因芯片等,为中蜂囊状幼虫病毒检测方法的改进和优化提供参考。

贵州省中华蜜蜂囊状幼虫病的发病情况与流行规律调查

为了解贵州中华蜜蜂囊状幼虫病的发病情况与流行规律,采用文献查阅、问卷及实地调查、定期监测方法对其发病季节、致病因素、发病率等情况进行分析研究。结果:该病自1974年传入贵州,一年四季均可发生,发病高峰期为2—6月、10月—次年1月,病因与气温、群势、饲养水平、蜂王质量等有关;近5年全省蜂场发病率为60.27%,大部分蜂场蜂群发病率为25%;91.78%的蜂农能通过症状判断蜂群患病,主要采取做好四季管理、及时补饲、密集群势、人工断子、换王、及时消毒等措施进行防控,辅以药物治疗,病害未对贵州蜂场造成重大损失。结论:中华蜜蜂囊状幼虫病在贵州的发病情况较平稳,应注意防范患病蜂群并发或继发其他病害。

中蜂囊状幼虫病毒PCR检测技术概述

中蜂囊状幼虫病是由中蜂囊状幼虫病毒引起的一种病毒病,是危害中蜂蜂群的主要病害之一。到目前为止,该病还没有特效药物可以治疗,我国大部分中蜂饲养地区由于该病的发生损失惨重。快速、高效、灵敏度高的检测方法对早期预防该病的发生和传播具有重要意义。本文就中蜂囊状幼虫病的检测技术进行了综述,旨为中蜂囊状幼虫病的检测和防控提供参考。

中华蜜蜂囊状幼虫病毒和东方蜜蜂微孢子虫顺序感染对中华蜜蜂营养和免疫的影响

【目的】中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)和东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae都是严重威胁蜜蜂健康的重要病原,本研究旨在探究2种病原顺序感染对中华蜜蜂Apiscerana cerana存活率、营养代谢和免疫的影响。【方法】设置中华蜜蜂取食正常食物、先喂食CSBV后喂食东方蜜蜂微孢子虫和先喂食东方蜜蜂微孢子虫后喂食CSBV3个处理,利用PCR检测中华蜜蜂在取食第2天和第4天后体内病原增殖情况;通过RT-qPCR检测中华蜜蜂感染病原后第2天和第4天后体内CSBV数量以及营养代谢基因(ilp1、ilp2、hexamerin70b和hexamerin70c)和免疫应答基因(toll、relish、jra、apidaecin、abaecin、defensin、hymenoptaecin和JAK)的表达情况。【结果】先喂食CSBV后喂食东方蜜蜂微孢子虫组的中华蜜蜂体内孢子量高于先喂食东方蜜蜂微孢子虫后喂食CSBV组,而先喂食CSBV后喂食东方蜜蜂微孢子虫组的中华蜜蜂体内CSBV拷贝数显著高于先喂食东方蜜蜂微孢子虫后喂食CSBV组。先喂食CSBV后喂食东方蜜蜂微孢子虫组的中华蜜蜂营养代谢基因ilp1、ilp2、hexamerin70c和hexamerin70b的表达水平随感染时间延长逐渐呈现下调,而先喂食东方蜜蜂微孢子虫后喂食CSBV组中显著上调。先喂食CSBV后喂食东方蜜蜂微孢子虫组中华蜜峰免疫基因toll和relish表达量呈现先增加后下降,而jra、JAK、apidaecin、abaecin、defensin和hymenoptaecin的表达量显著增加,而先喂食东方蜜蜂微孢子虫后喂食CSBV组中8个免疫基因的表达量均显著增加。【结论】在顺序感染过程中,东方蜜蜂微孢子虫的感染抑制CSBV的增殖,而CSBV的感染则有助于东方蜜蜂微孢子虫的增殖。先喂食CSBV比先喂食东方蜜蜂微孢子虫对中华蜜蜂营养和生长发育的影响更显著,且更易引起宿主的免疫防御,表明CSBV与东方蜜蜂微孢子虫顺序感染中蜂后引起的免疫应答及营养代谢更为复杂。

中华蜜蜂囊状幼虫病毒在Sf9和S2细胞系中的感染性研究

【目的】调查研究中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9和果蝇S2胚胎细胞(Schneider’s Drosophila Line 2)中的感染性。【方法】以Sf9和S2作为CSBV体外感染的细胞系,通过RT-PCR检测CSBV的Vp1基因表达情况从而判断CSBV是否能在两种细胞中感染并增殖。【结果】在S2细胞中并未检测到CSBV,说明CSBV不能感染该细胞;接种了CSBV的Sf9细胞中并未表现出明显的致细胞病变效应(CPE),但在该细胞总RNA中可检测到Vp1基因的转录。通过克隆测序发现,从接种CSBV的Sf9细胞中克隆得到的Vp1基因序列与CSBV重庆分离株Vp1基因(NCBI登录号:KJ716806)同源性高达99%。系统进化分析显示,该序列与囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)中国分离株聚为一簇。但是,当感染CSBV的细胞传至第3代时检测不到CSBV。【结论】CSBV不能感染S2细胞而能感染Sf9细胞,且不能在后者中进行增殖,暗示后者可能含有某类可清除CSBV的因子,从而为寻找CSBV寄生增殖所必需的细胞因子提供了线索。

中华蜜蜂囊状幼虫病病毒CSBV-BJ/2010基因克隆及序列分析

对来自福建、浙江和北京地区的中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese Sac Brood Virus,CSBV)进行了PCR鉴定,并对来自北京地区的病毒株CSBV-BJ/2010结构基因片段进行了克隆及系统进化分析。结果表明:RT-PCR方法获得了426bp的cDNA片段;所获得序列与GenBank中CSBV-LN/2009病毒株基因序列相似度达90%;序列系统进化分析表明,不同地理来源蜜蜂囊状幼虫病毒(Sac Brood Virus,SBV)可以分为3类,本实验分离得到的CSBV-BJ/2010序列与Isolate A26non structrual gene进化关系较近,而与其他来自欧洲、亚洲的SBV序列同源性差异较大。推测该病毒可能存在着毒力分化。

重庆中华蜜蜂囊状幼虫病病毒多聚蛋白基因分子特性分析

【目的】分析地处中国南方的重庆地区中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称"中蜂")囊状幼虫病病毒(sacbrood virus,SBV)(Ac SBV-S.Chn-CQ)的遗传特性。【方法】采用RT-PCR法对采自重庆23个区县的阳性中蜂幼虫进行SBV多聚蛋白基因扩增、序列测定和序列分析,采用邻接法(neighbor-joining method)基于基因组和基因组片段SB11-SB12构建系统进化树,使用RDP3检测SBV的基因重组。【结果】Ac SBV-S.Chn-CQ与中国南方中蜂SBV(Ac SBV-S.Chn)其他分离株、越南北部东方蜜蜂A.cerana SBV(Ac SBV-N.Vie)、越南北部西方蜜蜂A.mellifera SBV(Am SBV-N.Vie)、韩国东方蜜蜂SBV(Ac SBV-S.Kor)的同源性较高。Ac SBV-S.Chn-CQ在结构蛋白编码区域存在连续51个核苷酸缺失,在非结构蛋白编码区域有3个不连续的核苷酸缺失,与Ac SBV-N.Vie,Am SBV-N.Vie和Ac SBV-S.Kor核苷酸缺失相同。Ac SBV-S.Chn-CQ与Ac SBV-S.Chn-FZ,Ac SBV-N.Vie,Am SBV-N.Vie和Ac SBV-S.Kor在亚洲基因型中形成一亚型,亚型内检测到重组事件。【结论】推测Ac SBV-S.Chn-CQ与SBV-N.Vie和Ac SBVS.Kor可能来自一个共同祖先。

中华蜜蜂囊状幼虫病病毒非结构蛋白抗体的制备及其应用

应用Gateway重组技术构建CSBV非结构蛋白,RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)的原核表达载体,将重组表达载体转化大肠杆菌Rosetta,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)诱导获得RdRp基因原核表达蛋白.以重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备相应的多克隆抗体,Western blot检测表明,该抗体能与RdRp重组蛋白和感病中华蜜蜂幼虫蛋白特异性结合,说明获得的抗体特异性高.利用制备的抗体进行免疫荧光标记,发现其能特异地定位在感病中华蜜蜂血淋巴细胞内.

囊状幼虫病病毒侵染对中华蜜蜂营养和免疫反应的影响

【目的】囊状幼虫病病毒(sacbrood virus, SBV)是严重危害中华蜜蜂Apis cerana cerana蜂群健康和种群数量的病原微生物,但其对蜜蜂的致死机制不明。本研究旨在探究SBV对不同发育阶段中华蜜蜂营养代谢和免疫的影响。【方法】分别给中华蜜蜂2日龄幼虫和新羽化成虫饲喂SBV,逐日统计死亡蜜蜂数量,检测病毒对蜜蜂存活的影响;利用qPCR检测中华蜜蜂4日龄幼虫、预蛹以及10和20日龄成虫体内SBV RNA、营养代谢基因(ilp1,ilp2,hex110,hex70b,hex70c和vg)、先天性病毒免疫基因(rel,toll,apidaecin,abaecin,defensin,hymenoptaecin,jra,key和state92e)、细胞凋亡基因(atg7和LOC100577876)和抗RNA病毒基因(dis3和dicer)的表达水平。【结果】SBV感染显著降低了中华蜜蜂幼虫的存活率,但对成虫的生存影响不明显。SBV RNA在中华蜜蜂4日龄幼虫和预蛹体内的表达量显著高于其在10和20日龄成虫体内的表达量。SBV显著降低了中华蜜蜂幼虫营养代谢基因ilp1,ilp2,hex110,hex70b和hex70c以及成虫营养代谢基因vg和hex110的表达量,但显著提高了4日龄幼虫rel,toll,apidaecin,abaecin,defensin,hymenoptaecin和jra以及成虫key和state92e等先天性病毒免疫基因的表达量,还引起预蛹体内的细胞凋亡基因atg7和LOC100577876的表达量显著增加。【结论】SBV在中华蜜蜂幼虫和预蛹体内的感染水平远高于在成虫体内的,其对幼虫的危害也大于对成虫。SBV显著影响了中华蜜蜂正常的营养代谢,染毒中华蜜蜂能够提高自身的免疫水平来应对;预蛹期中华蜜蜂幼虫细胞凋亡水平的显著增加可能与化蛹异常及死亡有关。

中华蜜蜂囊状幼虫病病毒江西株衣壳蛋白vp1基因的克隆及序列分析

为了克隆中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)江西株衣壳蛋白vp1基因,并分析其序列特征,试验采用PCR扩增、克隆、测序及序列分析的方法对其进行了研究。结果表明:CSBV江西株vp1基因核酸序列大小为973 bp,编码324个氨基酸,蛋白分子质量为36.58 ku;序列分析显示,CSBV江西株vp1基因与CSBV重庆株vp1基因相似性最高,两者核酸序列的一致性为97.23%,氨基酸序列一致性和相似性均为99.07%;系统进化树分析显示,CSBV江西株与CSBV重庆株聚为一支。说明CSBV江西株与CSBV重庆株亲缘关系最近。

基于TaqMan探针的蜜蜂囊状幼虫病病毒荧光PCR检测方法的建立和应用

为建立快速有效的蜜蜂囊状幼虫病检疫方法,依据TaqMan荧光标记探针技术原理,针对蜜蜂囊状幼虫病病毒保守序列,设计出一对特异性引物和一条探针,建立了一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病病毒的荧光PCR方法。该方法对蜜蜂囊状幼虫病的检测具有较好的特异性,与蜜蜂急性麻痹病病毒、蜜蜂慢性麻痹病病毒、蜜蜂残翼病病毒和黑蜂王台病病毒之间均无交叉反应。检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL阳性质粒,可对低病毒含量的样品进行准确检测。重复性和稳定性试验结果显示,变异系数为1.6%,说明该方法具有较好的重复性和稳定性。应用该方法对蜜蜂及蜂制品进行检测,结果显示所建立的荧光PCR检测方法4h内即可报告检测结果,该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等优点,适用于蜜蜂及其制品中蜜蜂囊状幼虫病病毒的快速检疫。

蜜蜂囊状幼虫病病毒的基因型分析

为了解蜜蜂囊状幼虫病病毒的遗传进化规律,依据SB14f/SB15r引物所扩增的RNA依赖的RNA聚合酶基因片段序列对该病毒进行基因型分析。结果表明,该病毒主要分为欧洲型、远东型和南非型3个基因型。欧洲基因型分为中欧和英国亚型,远东基因型分为东方蜜蜂和西蜂亚型。提示蜜蜂囊状幼虫病病毒总体上按地域分型。

蜜蜂囊状幼虫病毒病的Nest-PCR检测

蜜蜂的囊状幼虫病是中华蜜蜂常见且危害严重的疾病,病原为一小正链RNA病毒。如何尽早鉴别蜂群的感染在养蜂业生产上具有重要的意义。本文报道一种利用RNA反转录结合巢式PCR检测鉴定蜜蜂的囊状幼虫病毒病的方法。

蜜蜂囊状幼虫病毒多聚蛋白基因遗传结构分析

为了解蜜蜂囊状幼虫病毒的遗传变异及分化,采用多聚蛋白基因对其进行遗传结构分析.结果表明:在比对的441bp基因片段中,有356个保守位点,85个变异位点,无缺失位点.构建系统进化树显示该病毒存在3个明显的分支,分支Ⅰ为中国的重庆、云南病毒株;分支Ⅱ为印度病毒株;分支Ⅲ为德国、英国、奥地利、韩国病毒株.中国、韩国、尼泊尔、印度等亚洲地区存在多个病毒株.中介网络图显示病毒株基本按照宿主种类进行聚类,表明同一地区存在多个病毒株系可能与宿主有密切关系.

检测蜜蜂囊状幼虫病毒环介导等温扩增技术的建立

为建立一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病毒（SBV）的环介导等温扩增方法（LAMP）,本研究根据SBV-UK株多聚蛋白基因序列（AF092924.1）设计了4条特异性引物,通过LAMP real-time Turbidimeter仪对SBV的反应体系和反应条件进行检测和实时监控,并评价其特异性、敏感性、重复性和稳定性。结果显示,在63℃恒温扩增40 min后,仅SBV核酸扩增,而其他病毒均呈阴性。反应结束后在反应体系中加入SYBR Green I的可视化判定结果与real-time Turbidimeter仪检测结果一致;该方法具有较强的特异性和较高的敏感性,其最低检出量为3.2×10~1拷贝/μL,是普通PCR的100倍;对同一批次和不同批次提取的SBV核酸进行扩增,结果表明重复性和稳定性良好;临床样品检测结果表明LAMP法与常规PCR法检测结果一致。本研究建立的LAMP方法操作简便,适用于SBV的快速检测。

辽宁地区中华蜜蜂囊状幼虫病的RT—PCR检测

蜜蜂的囊状幼虫病是中华蜜蜂常见且危害严重的疾病。通过RT-PCR方法,我们在辽宁地区检测出了该病,并且辽宁地区的蜂囊状幼虫病病毒与早期我国在广东地区检测到的中蜂囊状幼虫病病毒基因序列有所不同,推测中蜂囊状幼虫病病毒可能存在地区的差异性。