SARS-CoV-2S蛋白mRNA疫苗对不同毒株交叉中和活性的研究

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)在感染和持续性进化过程中不断发生变异,导致现有疫苗的有效性降低,因此人类迫切需要能够建立广谱免疫保护的有效疫苗.作者采用mRNA疫苗技术,设计了原型(Prototype)株刺突(Spike,S)蛋白mRNA疫苗(P0).在S蛋白基因序列中引入氨基酸突变位点,制备了Prototype-mut mRNA疫苗P1~P7,并对小鼠进行了免疫.结果表明,引入Q498R-Y505H-H655Y和Q498R-N501Y突变位点的S蛋白mRNA疫苗可以显著提升对Delta株的中和抗体(neutralizing antibody,NAb)滴度(P<0.05).引入Q493R-Q498R-H655Y和Q498R-N501Y突变疫苗对Prototype、Alpha、Beta、Delta、Omicron BA.1等多个毒株的几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)分别为1∶194.0、1∶73.5、1∶32.0、1∶194.0、1∶16.0和1∶294.1、1∶294.1、1∶64.0、1∶256.0、1∶8.0.同时,引入Q493R-Q498R-H655Y、Q498R-Y505H和Q498R-Y505H-H655Y等突变疫苗对Prototype、Alpha、Beta、Delta 4种毒株的中和抗体阳转率可达到100%.通过在S蛋白mRNA疫苗中引入点突变的策略,验证了可能具有免疫逃逸或改变受体结合亲和力潜力的氨基酸突变位点的引入对mRNA疫苗交叉中和活性的影响,这为提升mRNA疫苗广谱性的研发提供了参考.

鼠痘病毒EVM135和EVM085蛋白免疫原性及抗体中和活性的鉴定

正痘病毒属病毒的A33和H3L蛋白是其成员共有的中和抗体的两个主要靶标。为检测鼠痘病毒(ectromelia virus,ECTV)A33和H3L蛋白同源物的免疫原性及抗体中和活性,以ECTV-Moscow株基因组DNA为模板,PCR扩增A33和H3L同源基因EVM135、EVM085目的序列,分别构建pET30a-EVM135、pET30-EVM085原核表达载体,转化Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达,利用镍层析柱纯化并进行逐步透析复性,免疫兔制备多克隆抗体。建立间接ELISA方法测定其抗体效价分别达1∶120000和1∶360000,Western blot和IFA证实该多克隆抗体具有良好的特异性和反应性;ECTV病毒中和试验表明抗EVM135多克隆抗体中和效价为1∶16,而抗EVM085多克隆抗体效价为1∶128。本研究通过高效表达EVM135和EVM085蛋白,并分析其免疫原性及抗体中和活性,为深入研究痘病毒致病和免疫机理,进而快速建立其诊断方法,为猴痘防控技术措施的研究奠定基础。

用于构建抗人TNF嵌合抗体的鼠单克隆抗体中和活性的鉴定

目的:筛选构建抗人TNF嵌合抗体所需高质量的鼠源性mAb。方法:从一组分泌抗人TNF mAb杂交瘤细胞中,挑取3株D2、E6和F6,按常规方法制备腹水。用饱和硫酸铵盐析后,分别用蛋白A亲和层析和QFF阴离子交换层析法,纯化D2株分泌的mAb(IgG2b)和E6和F6株分泌的mAb(均为IgGl)。纯化前后,3株mAb的效价,采用间接ELISA法测定。纯化的3株mAb的中和活性,通过它们对TNF诱导的L929细胞死亡和上调ECV304细胞上ICAM-1表达的抑制作用来进行鉴定。结果:间接ELISA检测表明,3株mAb D2、E6和F6纯化前的效价分别为1×10-6、1×10-7和1×10-7,纯化后效价分别为0.01、0.002和0.002 mg/L。mAb中和活性的检测表明,浓度为0.16、0.40和0.50 mg/L的D2、E6和F6,可保护2×104U/L TNF诱导的L929细胞半数不发生死亡。1.0 mg/L的mAb D2、E6和F6,对2×105U/L TNF使ECV304细胞上ICAM-1表达上调的抑制率,分别为70.1％、60.1％和60.1％;3株mAb的浓度降到0.1 mg/L时,抑制率仍可达到60.1％、53.7％和59.0％。结论:所选3株mAb的效价及中和活性均较高,可作为抗人TNF嵌合抗体的候选mAb。

空斑法筛选具有中和活性的抗衣原体粘连蛋白McAb

本研究制备了抗１８ｋＤａ粘连蛋白的单克隆抗体，并证实在不同血清型之间，甚至不同种衣原体之间１８ｋＤａ粘连蛋白具有一定的共同抗原表位。我们建立的空斑形成试验和单克隆抗体空斑减少中和试验，实验结果明显、客观，易于判定，稳定性好。用此筛选出县有中和活性的２Ｂ９ＭｃＡｂ。该ＭｃＡｂ不同于目前已报道的ＭｃＡｂ，其中和活性不依赖于补体，而可能是抑制衣原体的粘附。

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性。方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性。结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0×107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv。经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体。经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg。结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础。

抗人IL-1β单链抗体的构建及其中和活性的检测

目的:原核表达抗人IL-1β(hIL-1β)的scFv,并对纯化后抗体的特异性、亲和力以及中和活性进行检测,为研制治疗类风湿关节炎的小分子抗体药物奠定基础。方法:使用PCR方法从含有抗hIL-1β抗体基因的质粒中获得抗hIL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b(+)中,构建重组表达载体pET-27b-A-hIL-1β-scFv。将该载体转化大肠杆菌Rosetta后诱导表达,经包涵体变性、复性得到可溶的抗hIL-1βscFv蛋白。利用高效液相色谱仪对其纯度进行分析后使用Western blot和ELISA方法测定scFv抗体对抗原特异性结合能力和亲和力,使用MTT的方法检测scFv抗体中和人IL-1β蛋白的能力。结果:成功地对抗hIL-1β单链抗体进行构建、诱导、表达和纯化。得到纯度为72.05%、相对分子质量约为28 ku的目的蛋白。ELISA和Western blot结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力。MTT实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断hIL-1β刺激L929细胞的增殖。结论:通过原核表达系统得到的抗hIL-1β单链抗体,纯化后,鉴定其与hIL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和hIL-1β的活性,为进一步研究治疗RA的小分子抗体奠定了基础。

E.coli表达HEV ORF2编码蛋白第112～607氨基酸片段的免疫原性及其诱生抗体的病毒中和活性

目的 探讨E.coli表达的戊型肝炎病毒(HEV)ORF2编码蛋白第112～607氨基酸片段(pORF2-56K)的免疫原性及其诱生抗体的病毒中和活性。方法 pORF2-56K免疫小鼠和豚鼠,用ELISA检测血清抗体效价。将HEV毒种与高效价豚鼠灭活血清在体外孵育后,接种于2BS细胞,用RT-PCR检测病毒RNA的复制情况。结果E.coli表达的pORF2-56K可诱导机体产生高水平的HEV特异性抗体和强烈的免疫记忆。该抗体可在体外有效中和HEV,使之失去在2BS细胞中有效复制的能力。结论 E-coli表达的pORF2-56K具有良好的免疫原性,且其诱生抗体具有中和HEV的能力,可作为HEV重组疫苗的候选抗原。

人源抗破伤风毒素单克隆抗体的中和活性和预防治疗作用

目的 考察人源抗破伤风毒素单克隆抗体的中和活性及体内预防治疗作用。方法 对分泌人源抗破伤风毒素单克隆抗体(人源单抗)的两株细胞进行培养,并对其抗体进行纯化及检定。结果 人源单抗在小鼠体外具有中和活性。较高的剂量可完全中和毒素,延长小鼠生存时间。不同的人源单抗中和活性不同。单抗在小鼠攻毒实验中均具有一定的预防和治疗作用。结论 人源单抗可用于破伤风感染的预防治疗。

具有中和活性的抗人IL-1β单链抗体的构建

目的构建抗人IL-1β单链抗体(anti-hIL-1βscFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行生物学活性检测。方法使用PCR的方法从含有抗人IL-1β抗体基因的质粒中获得抗人IL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b中,构建重组表达载体pET-27b-hIL-1βscFv。将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后诱导表达,经凝胶过滤色谱柱上复性得到可溶的抗人IL-1β的scFv蛋白。使用ELISA方法鉴定scFv抗体的特异性结合活性,使用Real time-PCR的方法检测scFv抗体的中和活性。结果成功地对抗人IL-1β单链抗体进行诱导、表达和复性,蛋白相对分子质量约为28 000。ELISA结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力。Real time-PCR实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断人IL-1β刺激人T细胞表达细胞因子IL-18及IL-1β的作用。结论通过原核表达系统得到的抗人IL-1β单链抗体经复性后,与人IL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和活性,为进一步研究人IL-1β相关疾病及其治疗性抗体奠定了基础。

抗鸡传染性法氏囊病病毒抗体Fab的表达及其中和活性的测定

为表达抗鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体Fab并检测其中和活性,本研究将抗IBDV抗体的轻链(L)和重链片段(Fd)基因分别克隆于p ET-27b(+)载体中,并转化于大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。将L和Fd片段包涵体蛋白变性后等量混合于复性液中,制备Fab并对其进行活性鉴定。结果显示L和Fd蛋白相对分子质量大小分别为25 ku和28 ku。Western blot和ELISA检测结果表明,获得的抗体Fab大小约为50 ku,并且与VP2蛋白和不同病毒株均具有特异性结合能力。体外中和试验结果表明,获得的IBDV抗体Fab具有中和活性,可以有效阻断IBDV(B87株)对鸡胚成纤维细胞(DF1)的感染。本实验获得的IBDV抗体Fab有望成为治疗IBD的候选生物制剂,为研制治疗IBD抗体制剂奠定了基础。

具有中和活性抗人类腺病毒单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备具有中和活性抗人类腺病毒(HAdv)单克隆抗体(mAb),并进行鉴定与应用。方法:以活的人类腺病毒3型(HAdv-3)滴鼻免疫BALB/c鼠,用细胞融合技术制备抗HAdv的mAb细胞株,采用中期分裂相秋水仙素阻抑法对mAb细胞株染色体进行分析;使用鼠mAb亚型鉴定试剂盒进行抗体亚型鉴定,通过ELISA、Western blot和间接免疫荧光技术进行特异性鉴定。建立HAdv-3感染动物模型,用获得的HAdv-3 mAb进行保护性研究。结果:细胞融合率为86%,抗HAdv抗体阳性孔率为51.4%。鉴定1株杂交瘤细胞(1A4),染色体数为98条,抗体亚类属IgG2a/κ,抗体腹水ELISA效价达10-5。ELISA、Western blot和间接免疫荧光证实该mAb特异性好。该mAb对HAdv-3感染动物有保护性作用。结论:成功地制备具有中和活性的抗HAdv mAb。该mAb识别的是HAdv六邻体蛋白,对HAdv-3感染动物有保护作用。

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白多克隆抗体的制备及其中和活性研究

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N蛋白鼠源多克隆抗体并验证其中和活性,试验采用RT-PCR方法扩增了PRRSV的ORF7基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达重组N蛋白,纯化重组N蛋白制成弗氏佐剂抗原,采用皮下多点注射法免疫Balb/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,以血清中和试验和间接免疫荧光法验证其中和活性。结果表明:试验成功扩增了大小为390 bp的ORF7基因片段,经双酶切和序列测定,重组表达质粒pET-32a-N构建成功,重组N蛋白分子质量约为28.0 ku,制备的多克隆抗体效价较高,重组N蛋白多克隆抗体按照1∶2、1∶4和1∶8比例稀释时,荧光数量与不加多克隆抗体时比较无明显区别。说明在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达了PRRSV重组N蛋白,制备的鼠源多克隆抗体能够与重组N蛋白发生特异性反应,但没有抗PRRSV中和活性。

一种筛选中和活性抗人TNF单抗细胞模型的建立及其应用

目的:建立一种筛选中和活性抗人肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)mAb细胞模型,并从一组抗人TNFmAb中筛选出具有相对较高中和活性的mAb.方法:用含100mL/LFCS的DMEM细胞培养液将L929细胞的浓度调整到1×108/L,按每孔100μL,加入至96孔细胞培养板中,培养过夜.弃细胞培养上清后,将200μL的实验液转入培养板中,继续培养16h.活细胞用结晶紫染色,脱色后,于570nm波长测定A值.结果:浓度在0.3～0.5mg/L范围内的放线菌素D(antinomycinD,ActD)对L929细胞的生长抑制作用比较稳定;TNF的浓度高于20kU/L时,能够使95%以上的实验细胞发生凋亡;浓度在12.5～50.0μg/L范围的mAb对TNF的中和作用具有明显的剂量依赖关系;在ActD,TNF和mAb的浓度分别为0.35mg/L,20kU/L和25.0μg/L的条件下,发现D2的中和活性与阳性对照抗体无显著性差异(P>0.05),但高于阴性对照抗体,E6,D12,E11(P<0.01).与阴性对照抗体比较,E6,E11也具有一定的中和活性(P<0.05),而D12无中和活性(P>0.05).结论:本研究建立的mAb抑制TNF诱导L929细胞凋亡的细胞模型可用于筛选中和活性抗TNFmAb;D2的中和活性相对较高,可作为构建治疗性嵌合抗体的制剂.

N-糖链切除对重组抗狂犬病毒单克隆抗体中和活性的影响

重组抗狂犬病毒单克隆抗体是一种全人源的抗病毒感染单抗,主要用于狂犬病毒暴露后预防。采用糖苷酶处理2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体Mab1、Mab2水解切除N-糖链,通过糖染色和毛细管电泳检测确定N-糖链酶解程度,利用快速荧光灶抑制试验检测其中和活性,分析N-糖链切除对该单抗中和活性的影响。结果显示,N-糖链切除后抗体中和活性无明显变化。说明N-糖链对这两株抗狂犬病毒单抗的体外中和活性不是必须的结构成分。

具有中和活性抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备具有中和活性抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体。方法 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体 ,并以ELISA结合免疫组化技术进行筛选。结果 获得 8株分泌抗呼吸道合胞病毒的特异性单克隆抗体的细胞株 ,其中 2株分泌的单抗具有中和活性 ,效价 1∶16 0和 1∶32 0。

大鼠TNFR-Fc重组腺相关病毒载体的构建、表达及中和活性鉴定

目的构建携带大鼠肿瘤坏死因子II型受体胞外区(TNFR)融合大鼠IgG Fc片段的重组2型腺相关病毒载体(pAAV2/TNFR-Fc),并对目的蛋白TNFR-Fc的表达和生物学活性进行初步鉴定,为后续的类风湿关节炎基因治疗研究做准备。方法构建大鼠TNFR-Fc融合基因重组腺相关病毒(AAV)载体,体外转染293T细胞,收集转染上清,以ELISA和Western blot等方法检测目的蛋白的表达,并应用L929细胞测定重组表达产物的TNF-α细胞毒中和活性。结果成功构建重组表达载体pAAV2/TNFR-Fc,在转染细胞上清中检测到目的蛋白TNFR-Fc的表达,其可有效中和大鼠TNF-α的L929细胞毒活性。结论成功构建了大鼠TNFR-Fc融合基因,并验证了其在2型AAV载体上的分泌性表达,为进一步病毒包装及动物实验奠定了基础。

重组人BD3-BPI的内毒素中和活性及其在高盐环境中抗菌活性的稳定性

目的：验证重组人BD3-BPI（rhBD3-BPI）是否具有内毒素中和活性，研究其在高盐环境中是否能保持抗菌活性。方法：根据内毒素标准品绘制内毒素活性标准曲线，将100 μL梯度稀释的rhBD3-BPI-与100 μL 10EU／mL脂多糖（LPS）混匀，37℃水浴60min，同时设标准对照（只含10EU／mL LPS的标准品溶液），并以无热源水作为空白对照，采用基质显色法进行鲎试验测定LPS的活性；将6×10^8 CFU／mL的革兰阳性和阴性标准菌株及临床分离的多药耐药菌株接种于含1mg／mL rhBD3-BPI和0～250mmol／L不同浓度NaCl的液体细菌培养基中，37℃培养3h后用10mmol／L磷酸钠按1：1～1：1000的比例稀释，铺LB培养基平板，37℃过夜培养，观察各平板菌落生长情况，计数并计算杀菌率。结果：在5EU／mL的标准内毒素体系中，当rhBD3-BPI的浓度高于4μg／mL时即开始表现出一定的内毒素中和活性，当rhBD3-BPI的浓度分别为16、32 μg／mL时，其内毒素中和率分别为23％和88％，随后rhBD3-BPI对内毒素的中和活性趋于平稳，50 μg／mL的rhBD3-BPI对所有受检菌均表现出100％的杀伤效应。当NaCl浓度低于150mmol／L时，rhBD3-BPI对各受检菌的杀菌活性均未受明显影响；NaCI浓度升高至150-200mmol/L，rhBD3-BPI对各受检菌的杀菌活性有所下降，但其杀伤率仍在90％以上；当NaCl浓度高于200mmol／L时，盐浓度对rhBD3-BPI杀菌活性的影响才较为明显，但即使NaCl浓度达到250mmol／L，rhBD3-BPI的杀菌活性仍保持在85％以上。结论：rh-BD3-BPI具有内毒素中和活性，在高盐环境中具有良好的抗菌活性稳定性。

1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的抗血清中和活性分析及B细胞表位鉴定

旨在探究1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)VP3蛋白抗血清的中和活性并鉴定VP3的线性B细胞表位。利用pGEX-4T-1表达载体,在BL21(DE3)宿主菌中原核表达DHAV-1 VP3基因,以切胶纯化出的蛋白质为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过鸡胚中和试验对多抗的中和效价进行检测;采用Karplus&Schulz、Emini、Jameson-Wolf和Parker方法分别对柔韧性、表面可及性、抗原性及亲水性进行分析,得到了4条候选线性B细胞表位,以制备的兔抗VP3多克隆抗体为一抗,通过间接ELISA方法对人工合成的B细胞表位进行鉴定,并进一步用临床鸭血清样品对鉴定的B细胞表位的抗体检测能力进行评估。结果显示,VP3在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,大小约54ku,Western blot分析表明重组蛋白质具有较好的反应原性。制备的兔抗VP3多克隆抗体的琼扩效价达到1∶16,并能中和DHAV-1,中和效价为1∶39;利用间接ELISA鉴定出GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP(1—20aa)、FNTGRYQMSWYPIADGEQSL(131—150aa)和VNSSAPSNID(200—209aa)为VP3的B细胞表位,抗体检测能力试验结果显示表位肽可检测临床DHAV-1鸭血清。本研究表明DHAV-1VP3的抗血清具备一定的中和活性,1—20aa、131—150aa和200—209aa为VP3的B细胞表位且具有临床应用前景。

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白中和活性单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备具有中和活性的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究利用PRRSVSD53株的超离病毒作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠并进行细胞融合。采用PRRSVSD53株和真核表达的PRRSV各结构蛋白作为检测抗原,应用间接免疫荧光试验(IFA)筛选到一株稳定分泌抗SD53株GP4蛋白的杂交瘤细胞株(LM26)。抗体亚类鉴定其为IgG2a,轻链为κ链。原核表达一系列截短的GP4蛋白鉴定LM26的抗原表位结果显示,LM26识别的抗原表位序列为57VVLQDI^62,此抗原表位在美洲型PRRSV中相对保守。病毒中和试验结果显示,MAb LM26仅针对PRRSV SD53株具有中和活性,中和效价最高为1∶50,对其它美洲株PRRSV均不具有中和活性。该MAb的制备为进一步研究PRRSVGP4蛋白的结构和功能奠定了基础。

人巨细胞病毒单克隆抗体的制备及其体外中和活性鉴定

目的 制备具有中和人巨细胞病毒 (HCMV)感染作用的单克隆抗体并对其进行生物学活性鉴定。方法 用HCMV抗原免疫Balb/c小鼠 5、6次后 ,取致敏的脾脏B淋巴细胞和HGPRT SP2 /0小鼠骨髓瘤细胞进行融合 ,在HAT选择培养基中培养 2周 ,间接ELISA法筛选克隆。挑取分泌抗体的杂交瘤株 ,再用间接ELISA进行鉴定 ,最终获得抗HCMV的阳性杂交瘤细胞株 ,用Ouchterlony法鉴定McAb的亚类。小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞 ,取腹水经盐析法提纯IgG。Lowry法测定蛋白质浓度 ,在第 6代HF细胞株及原代培养新生乳鼠脑神经细胞上进行微量中和实验。结果 获得了 4株杂交瘤细胞株 ,制备的F9McAbs盐析后蛋白质浓度为 11 2g/L ,血清学试验证明该McAbs能和HCMV抗原进行特异性结合 ,制备的IgG具有高度特异性。且体外实验已证实 ,该McAb具有中和抗体的性质。结论 通过杂交瘤技术制备的HCMV单克隆抗体能在体外中和HCMV致病变效应 。