基于非标记分析方法应用四极杆-静电场轨道阱-线性离子阱三合一高分辨质谱仪鉴定中国仓鼠卵巢细胞膜蛋白

目的 探讨应用四极杆-静电场轨道阱-线性离子阱(Orbitrap fusion lumos)三合一高分辨质谱仪鉴定中国仓鼠卵巢(Chinese hamster overy,CHO)细胞的全蛋白质组和膜蛋白质组的非标记(label-free)分析方法,并评价其应用效果,为研究膜蛋白相关传染病的发生机制提供方法学基础。方法 贴壁培养中国仓鼠卵巢细胞,提取、富集和酶解处于对数生长期细胞的全蛋白和膜蛋白,用高效液相色谱仪联用四极杆-静电场轨道阱-线性离子阱三合一高分辨质谱仪对酶解后的多肽进行分析,利用Maxquant软件和Uniprot数据库进行搜库及鉴定,最后对鉴定膜蛋白进行基因本体论(gene ontology,GO)功能分类。结果 全蛋白组一共检测出14 300个肽段,搜库得到2708个蛋白,其中可信蛋白2002个(FDR<1%且特异性肽段>1);膜蛋白组一共检测出13 179个肽段,搜库得到2594个蛋白,其中可信蛋白1873个。在鉴定的全蛋白组和膜蛋白组中定量结果前20的蛋白中,全蛋白组中与膜相关的蛋白有4个,占比20%;膜蛋白组中与膜相关的蛋白有10个,占比50%。在膜蛋白组中,GO功能分类表明分子功能上主要涉及结合和催化活性,在生物学进程上主要涉及细胞进程、代谢过程等。结论 膜蛋白组中与膜相关的蛋白显著高于本实验的全蛋白组,基于非标记分析方法应用Orbitrap fusion lumos的分析技术是鉴定细胞膜蛋白的有效方法。

酵母和植物水解物在中国仓鼠卵巢细胞生产重组蛋白中的应用研究进展

目前,重组蛋白药物主要是由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达系统生产的。细胞培养技术特别是培养基是影响CHO细胞表达重组蛋白的关键因素。酵母和植物水解物作为细胞培养基的补充物,已广泛应用于无血清培养基的优化,以改善CHO细胞的生产性能,提高重组蛋白药物的质量和产量。本文综述了酵母和植物水解物在CHO细胞生产重组蛋白中的应用,以期为研发更安全、有效的无血清培养基及提高重组蛋白药物的产量提供参考。

改造中国仓鼠卵巢细胞

与原核细胞、酵母细胞以及昆虫细胞相比 ,中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)作为宿主细胞表达的外源蛋白最接近其天然构象 ,因而CHO细胞表达系统是生物工程制药最为理想的表达系统。但这种系统也存在诸多缺点。如在大规模培养中CHO细胞会面临着对无血清培养基的适应性差、细胞无限度增殖以及细胞凋亡等很多难题。所以除了在培养基、培养条件和表达载体方面下功夫优化该系统外 ,对CHO细胞本身进行改造已成为优化CHO表达系统的另一热点。

旋毛虫DNA疫苗在中国仓鼠卵巢细胞中的表达(英文)

目的 观察编码旋毛虫相对分子质量 (Mr) 3 10 0 0抗原的DNA疫苗 (重组真核表达质粒pcDNA3 TspE1)在中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞中的体外表达 ,并分析其表达产物的抗原性。 方法 通过用阳离子脂质体Lipofectamine 2 0 0 0将重组质粒pcDNA3 TspE1转染CHO细胞 ,G418筛选阳性克隆 ,用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、间接荧光抗体试验 (I FAT)、十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)对表达产物进行鉴定。 结果 RT PCR结果显示 ,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞在 876bp处有一条带 ,而用空质粒pcDNA3转染的CHO细胞未出现条带 ,表明pcDNA3 TspE1转染细胞中有TspE1基因转录。IFAT结果显示 ,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞与重组融合蛋白免疫小鼠血清反应呈现亮绿色荧光 ,而pcDNA3转染的CHO细胞及未转染细胞呈现橘黄色。Westernblotting显示在pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞培养液中存在有一Mr约 3 10 0 0的蛋白带 ,且该条带能被重组融合蛋白免疫小鼠血清、旋毛虫肌幼虫可溶性抗原免疫兔血清、感染旋毛虫的小鼠及旋毛虫病患者血清识别。 结论 重组质粒pcDNA3 TspE1可转染CHO细胞 ,旋毛虫TspE1基因可在转染的CHO细胞中表达 ,表达蛋白能分泌到细胞培养上清中且具有旋毛虫?

中国仓鼠卵巢细胞的悬浮适应及代谢特征

目的:通过悬浮适应,使中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)获得悬浮生长的特性,并可在悬浮培养条件下较快地生长。方法:将CHO细胞以3×105/mL接种于100mL的三角瓶内,培养时加入1%小牛血清、1g/LPluronic F-68、25μg/mL硫酸葡聚糖,培养体积35mL,摇床转速90r/min,每24h离心换液,当细胞增殖为2×106/mL时传代。结果:经过悬浮适应,细胞的平均比生长速率由适应最初的0.27/d提高为适应后的0.48/d,最大总细胞密度由适应初期的2.5×106/mL提高为适应后的6.3×106/mL,目的蛋白活性也由适应前的2781U/mL提高为适应后的8878U/mL,适应后细胞的葡萄糖平均比消耗率为1.42μmol/(106细胞·d),低于适应前的2.16μmol/(106细胞·d)。结论:贴壁生长的CHO细胞经过悬浮适应,不仅可以在悬浮培养条件下快速生长,而且细胞对葡萄糖的利用率也得到提高。

中国仓鼠卵巢细胞表达新技术

中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)是基因工程药物生产的最佳表达系统之一,在生物制药中被广泛应用。传统的获得高表达CHO细胞株的方法费时、费力。近年来出现了一些CHO细胞高效表达新技术,它们从克服位置效应,提高基因转录效率、mRNA翻译效率及稳定性、筛选高表达细胞的效率等不同层次调控外源基因在CHO细胞中的高效表达。与MTX加压扩增基因获得高效表达外源基因的方法比较,能够节约时间、减少工作量,不易丢失高表达细胞株。

转染中国仓鼠卵巢细胞人TSH受体的功能评价

目的研究转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞人促甲状腺激素(hTSH)受体(hTSHR)的功能。方法抽提已转染hTSHR的CHO细胞基因组DNA,PCR扩增目的条带,并对产物进行序列测定。采用受体的放射配体结合分析法,以固定量125I的牛促甲状腺激素(125I-bTSH)和浓度递增的未标记bTSH与hTSHR发生竞争结合反应分析受体的基本功能;通过TSH刺激试验测定细胞环磷酸腺苷(cAMP)含量,评价hTSHR的生物学活性。结果PCR扩增片段长度与预期相符,且序列完全正确。竞争结合反应表明,随着bTSH浓度的递增,125I-bTSH与hTSHR的结合量逐渐下降;TSH刺激试验显示,随着bTSH浓度的递增,细胞cAMP含量亦逐渐升高,当bTSH浓度为10 mIU/mL时,cAMP水平达到峰值。结论cDNA序列整合在CHO细胞基因组内并在细胞膜上表达的hTSHR,具有受体的基本功能特性和良好的生物学活性。该实验为自身免疫性甲状腺疾病患者血清甲状腺刺激性抗体(TSAb)和阻断性抗体(TSBAb)的检测奠定了基础。

中国仓鼠卵巢细胞和人胚肾T细胞骨架及其迁移特性的比较

【目的】比较中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人胚肾T(HEK293T)细胞的迁移能力,筛选适用于细胞骨架形态和外源基因对细胞迁移影响研究的细胞系。【方法】通过免疫荧光组织化学比较CHO和HEK293T细胞骨架的形态差异,通过延时成像和划痕试验比较细胞迁移能力,通过免疫印迹比较2株细胞系细胞骨架基因的相对表达,并从细胞骨架差异和结构基因的选择性表达方面解释细胞迁移能力的差异。【结果】CHO和HEK293T细胞系的细胞骨架在形态上存在较大差异,HEK293T细胞系的核质比是CHO细胞的2.25倍;CHO细胞比HEK293T细胞的迁移能力强,是HEK293T细胞的2.9倍;2种细胞内α-Tubulin/β-Actin的比率存在较大差异,CHO是HEK293T的1.2倍。【结论】细胞中微管微丝的差异性分布及结构基因Tubulin和Actin的选择性表达是细胞迁移特性不同的关键因素。CHO细胞适用于涉及细胞骨架形态和外源基因对细胞迁移影响的研究,HEK293T细胞不适用于此类研究。

人源靶向补体抑制物CR2-CD59在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达

目的构建人源靶向补体抑制物CR2-CD59,并筛选中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)高效表达细胞株。方法运用FuGENE6转染试剂,将含有人CR2-CD59的重组PEE14.1质粒转入CHO细胞,蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)筛选出阳性克隆,并利用无血清培养基对CHO细胞表达株进行培养获得重组蛋白,以ELISA、SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白进行鉴定。结果成功构建PEE14.1-CR2-CD59重组质粒,获得CHO细胞稳定表达株。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白CR2-CD59的相对分子质量同预期结果一致。ELISA和Western blot鉴定重组蛋白CR2-CD59可与CR2、CD59多克隆抗体特异性结合。且与含血清培养基相比,无血清培养基能明显提高CHO细胞的蛋白表达量(P<0.05)。结论在CHO细胞中成功表达人源靶向补体抑制物CR2-CD59。

非全长型人卵透明带-3蛋白慢病毒表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中表达的研究

目的:构建含非全长型人卵透明带-3蛋白(hZP3)的慢病毒载体,转染293FT细胞获得重组慢病毒颗粒,感染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)使其表达hZP3。方法:将hZP3基因序列插入到慢病毒系统的入门载体pENTR-11中构建为pENTR-hZP3,采用LR重组酶将pENTR-hZP3和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成新重组载体pLenti6/V5-DEST-hZP3。将该重组载体和其它viruspower 3个质粒载体充分混合,用阳离子脂质体转染293FT细胞,培养和待细胞完全裂解后收集富含hZP3基因的病毒颗粒上清液,取适量上清液感染CHO-K1细胞,采用杀稻瘟Blastcidin筛选,挑单克隆对其扩增培养,进行基因水平和蛋白水平的鉴定。结果:获得的含hZP3基因的病毒颗粒上清液滴度为1×105TU/ml,随机挑取的16株单克隆细胞中,有9株表达hZP3。结论:成功构建含hZP3的慢病毒表达载体,获得表达hZP3的CHO株,为后续研究与开发奠定了基础。

野生型人DNA polβ高表达中国仓鼠卵巢细胞系的建立及其生物学特征

脂质体转染法将野生型人DNA聚合酶beta(polβ)重组绿色荧光蛋白表达载体转染入中国仓鼠卵巢细胞系(CHO),经G418筛选得到稳定高表达人野生型polβ的CHO细胞.通过RT-PCR方法检测转染细胞polβmRNA的表达水平,流式细胞仪测细胞周期,软琼脂实验测细胞恶性增殖能力,6-TG实验测细胞自发突变率,以探讨转染细胞的生物学特性.结果显示,转染细胞polβ的mRNA的表达较空载体转染细胞、对照细胞增加,细胞周期多被阻滞在S期,细胞软琼脂集落形成率增高,自发突变率增加,表明polβ的过表达与细胞周期的分布、细胞恶性增殖程度、遗传稳定性相关.

稳定表达烟酸受体GPR109A的中国仓鼠卵巢细胞株的建立

目的将GPR109A基因插入pEGFP-N3载体中构建重组质粒pEGFP-GPR109A,并建立稳定表达烟酸受体GPR109A的中国仓鼠卵巢(Ch inese ham ster ovary,CHO)细胞株。方法构建重组质粒pEGFP-GPR109A,重组质粒转化大肠杆菌DH5 a,重组质粒经PCR、酶切、测序验证正确后,应用脂质体转染技术将该质粒导入CHO细胞,用抗生素G418筛选稳定表达的细胞。倒置荧光显微镜观察克隆细胞株荧光信号,RT-PCR检测GPR109A基因mRNA表达,W estern B lotting检测绿色荧光蛋白与烟酸受体GPR109A的融合蛋白(GFP-GPR109A)的表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果 pEGFP-GPR109A真核表达质粒构建正确,融合蛋白GFP-GPR109A在CHO细胞中稳定表达,表达的融合蛋白主要定位于细胞膜。结论成功构建pEGFP-GPR109A真核表达载体并建立其稳定表达的CHO细胞株;该细胞株的建立有助于GPR109A的更多生理病理功能研究,也为下一步抗动脉粥样硬化的药物筛选奠定了基础。

中国仓鼠卵巢细胞高效表达系统研究进展

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是最重要的重组蛋白表达系统之一,在生物制药中被广泛应用,但因生产成本高、细胞株构建时间长等因素限制了其应用。近几年随着对启动子、PolyA尾作用模式的深入了解,对构建高效稳定的质粒指明了方向;核基质结合区的应用突破了位置效应引起的基因沉默;荧光激活细胞分类术等细胞筛选技术为快速、高通量筛选高表达细胞株奠定了基础;RNA干扰技术及抗凋亡因子的应用,可改变CHO细胞的生物特性,使其更适应于发酵生产,提高了表达量。本文就质粒构建、筛选策略、CHO细胞改造等研究成果作一综述。

人突变CD59在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

①目的构建人突变CD59的真核表达系统,并筛选高表达细胞。②方法应用阳离子脂质体法将含有突变人CD59的重组pALTER质粒与pCDNA共转染入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞;G418筛选出阳性克隆,流式细胞术、免疫组化、免疫荧光、Western-blot筛选高表达CD59细胞。③结果成功构建人突变CD59的真核细胞表达系统;运用各种免疫学技术检测获得CD59高表达细胞。④结论人突变CD59在CHO细胞中高表达,为进一步研究CD59分子的功能奠定基础。

人血栓调节蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的表达与鉴定

目的 获得表达人血栓调节蛋白的CHO-TM细胞，以便研制临床诊断治疗制品。方法 重组表达质粒pTh402提纯后利用lipofectamine脂质体转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）．C418筛选后对阳性细胞用蛋白质印迹术（Westem blorting）定性检测人血栓调节蛋白（hTM）的表达情况。结果 血栓调节蛋白成功导入宿主细胞CHO并获得高效表达。结论 获得高效表达hTM的细胞CHO-TM，为进一步研究临床诊断治疗制荆创造了条件。

稳定、高效表达肝细胞生长因子的中国仓鼠卵巢细胞系的构建

目的:构建hHGF-pCDNA3.1表达载体,在中国仓鼠卵巢细胞中获得具有生物学活性的重组人肝细胞生长因子蛋白的高效、稳定表达。方法:RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pCDNA3.1(+)真核表达载体中,构建hHGF-pCD-NA3.1重组质粒并转染中国仓鼠卵巢细胞,经筛选得到了高效、稳定表达hHGF的细胞克隆,采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在中国仓鼠卵巢细胞中的表达。结果:酶切及测序结果表明重组质粒构建正确,RT-PCR显示细胞的rhHGF mRNA呈现高水平,ELISA检测hHGF在细胞中的分泌性表达,浓度达10ug/L。结论:成功地在中国仓鼠卵巢细胞中获得了hHGF蛋白的高效、稳定表达。为下一步将表达hHGF的细胞微囊化制备基因工程细胞,并移植用于相关疾病的基因治疗奠定了基础。

鱼露致中国仓鼠卵巢细胞HGPRT位点突变作用

背景与目的:研究鱼露及亚硝化鱼露对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞HGPRT位点突变的影响。材料与方法:分别将鱼露和亚硝化鱼露分成4个不同剂量处理组:5μl/ml、2.5μl/ml、1.25μl/ml、0.625μl/ml,另设阳性对照组(EMS:0.75μg/ml,不需代谢活化;MCA:4μg/ml,需代谢活化)和溶剂对照组(三蒸水),应用CHO/HGPRT基因突变试验,采用琼脂平皿法,检测鱼露和亚硝化鱼露对CHO细胞的毒性及突变体频率,评价鱼露及亚硝化鱼露引起突变的可能性。结果:经S9系统活化和未经S9系统活化的所有处理组突变体频率差异均有统计学意义(χ2S9-=41.115;FS9+=19.528;P均<0.01);亚硝化鱼露及经S9系统代谢活化后的鱼露组处理突变体频率均显著高于溶剂对照组(P<0.05或P<0.01),且存在剂量-效应关系(S9-:r亚硝化鱼露=0.986,P<0.05;S9+:r鱼露=0.950,P=0.05;r亚硝化鱼露=0.997,P<0.01);而未经S9系统活化的鱼露处理组与溶剂对照组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:鱼露经亚硝化后对CHO/HGPRT位点有致突变作用,经S9系统活化后可能也有此作用。

中国仓鼠卵巢细胞及其表达载体的改造

哺乳动物细胞因其表达的外源蛋白最接近天然构象,已成为生产重组蛋白药物的理想系统。其中,中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是目前最为常用的表达系统,但这种系统也存在很多缺点,如大规模培养中表达量低、生产成本高、细胞无限度增殖及细胞凋亡等。目前,通过优化培养基配方和培养条件很难从根本上解决上述问题,必须从整个表达系统着手进行改造,其中CHO细胞本身和表达载体的改造最为关键。

重组中国仓鼠卵巢细胞表达系统高效表达载体研究进展

生物制药是21世纪高科技产业,治疗性重组蛋白的生产是生物制药的重要部分。宿主细胞以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用途最为广泛,近70%宿主细胞是用CHO细胞表达系统生产的。影响外源蛋白在CHO细胞中表达的因素很多,其中表达载体是重要因素之一。构建重组CHO细胞表达系统高效表达载体可以利用核基质附着区、泛在染色质开放元件,构建特定位点重组载体系统,以及选择合适的内部核糖体进入位点及弱化筛选标记等实现。CHO细胞表达高效载体构建涉及多个因素,需要进行不同元件的优化,才可达到高效表达。

基因工程改造与中国仓鼠卵巢细胞凋亡

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是表达重组单克隆抗体常用的工程细胞。在细胞培养过程中,凋亡是限制重组蛋白产量提高的重要因素之一。对CHO细胞进行基因工程改造是抑制细胞凋亡的重要途径。主要从细胞凋亡信号途径、细胞信号通路以及microRNA等方面综述了运用基因工程手段对CHO细胞凋亡改造的进展,并探讨了潜在的基因工程靶点。