中国恒河猴Mamu-A^＊01基因筛查及其对抗原肽p11C的特异性CTL反应

目的筛查中国恒河猴Mamu-A*01基因,比较中国恒河猴和印度恒河猴的Mamu-A*01基因序列和功能是否相同。方法PCR方法检测128只中国恒河猴,用特异性引物扩增Mamu-A*01基因,将PCR扩增后的产物克隆测序后与印度恒河猴的Mamu-A*01基因进行同源比对;酶联免疫斑点检测(ELISPOT)方法分别检测5只Mamu-A*01基因阳性和5只阴性恒河猴针对SIV、SHIV抗原肽p11C的特异性CTL反应。结果共筛查出5只Mamu-A*01基因阳性恒河猴(3.91%),经测序分析后与印度恒河猴的同源性可达99.1%。这5只均为SIV/SHIV感染恒河猴,其中四只SIV感染的猴的ELISPOT结果显示针对p11C的高频CTL反应,斑点数在500-1400/106PBMCs之间,而另1只SHIV感染的恒河猴及5只阴性猴没有斑点出现。结论中国恒河猴含有Mamu-A*01基因,基因频率有区域性差异,中国恒河猴的Mamu-A*01可提呈特异性抗原肽p11C。

中国恒河猴感染SIV后T淋巴细胞初始、记忆亚群的变化

目的:对中国恒河猴感染猴免疫缺陷病毒(SIV)后CD4T初始、记忆亚群的细胞进行分析,了解各亚群的变化规律以及在AIDS发病过程中的意义。方法:使用SIVmac239毒株感染20只中国恒河猴,观察18个月;在感染前、后各时间点,使用实时荧光定量PCR(TaqMan探针法)进行病毒载量的检测;使用CD3/CD4/CD28/CD95表面标记的组合,进行CD4及其初始/记忆亚群比例的流式分析,并结合血常规检测的结果计算CD4及其各亚群的绝对数。结果:得到了CD4各个亚群在SIV感染后的变化曲线;并发现SIV感染后CD4减少的主体是中央型记忆(CM)CD4+T细胞;而初始型CD4+T在半数动物逐渐缓慢减少,但个体间差异较大。此外,还发现快速进展型RM449猴在死亡前其初始型及CM CD4仍较高,但其初始型CD4细胞在流式图上存在着类似"转化阻滞"的现象。结论:本研究展示了CD4细胞的初始、记忆亚群在感染SIV后的变化规律;对其进行细分研究,有助于更准确地了解体内免疫状态的变化,为临床疗效观察、免疫状态评估等提供参考。

健康中国恒河猴各淋巴组织中T淋巴细胞表型及分布

试验旨在明确T淋巴细胞在中国恒河猴各组织中的表型与分布,为疾病模型研究提供基础数据。取外周血、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结及肠道组织,从中分离出淋巴细胞。使用流式细胞术检测分析各种表型的淋巴细胞在组织间的分布。结果表明,淋巴结中CD4+/CD8+T细胞比值高于外周血,肠道固有层中最低,三者差异显著。记忆性T细胞在外周血和肠道固有层T细胞中比重较大,而淋巴结中主要为幼稚T细胞。CD4+T细胞中中心记忆T细胞Tcm为主要亚群,而CD8+T细胞主要为效应记忆细胞Tem。外周血与肠道固有层中增殖T细胞比例相当,而淋巴结中T细胞增殖水平相对较低。各组织中CXCR4受体表达量普遍高于CCR5受体,其中肠道固有层CCR5受体表达水平最高。值得注意的是,有一小群表型CD3+CD4+CD8low的细胞仅在肠道固有层中存在,经分析其功能活性应高于肠道CD4单阳性T细胞。因此,测定了健康中国恒河猴各表型T淋巴细胞在多种淋巴组织中的基础数值,为相关模型研究奠定基础。

中国恒河猴Mamu-B*1703/EGFP在K562和B16细胞中的表达及分布

目的分析恒河猴主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子重链的亚细胞分布,建立适于体外研究恒河猴MHCⅠ类分子表达和抗原呈递功能的细胞系。方法将含Mamu-B*1703重链基因真核表达载体pEGFP-N1分别转染K562和B16细胞,细胞收集后以W6/32单克隆抗体或抗Mamu-B*1703抗血清及PE标记二抗染色,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞术分析Mamu-B*1703复合体在细胞内和细胞表面的表达。结果在K562和B16细胞的细胞质内均可观察到与Mamu-B*1703重链基因融合表达的绿色荧光蛋白激发后的绿色荧光,即2种细胞均可表达外源Mamu-B*1703重链分子;但通过藻红蛋白标记的抗MHCⅠ类分子复合体抗体染色显示,Mamu-B*1703复合体仅表达于K562细胞表面,而不表达于B16细胞表面。结论Mamu-B*1703重链可与人K562细胞而不能与小鼠B16细胞内的βm轻链结合组装成复合体,表达于细胞表面,提示研究恒河猴的MHCⅠ分子表达应利用人类的细胞株。

中国恒河猴肠道菌群特征揭示

运用变性梯度凝胶电泳(DGGE)和实时荧光定量(q-PCR)技术分析6个年龄组恒河猴粪便样品中主要细菌情况,揭示肠道微生态特点。16S rRNA基因V3可变区PCR-DGGE指纹图谱显示条带丰富,割胶62条,克隆测序后与GenBank序列进行比对后构建进化树显示所有62个条带、43个OTUs属于4个门:厚壁菌门,放线菌门,拟杆菌门以及螺旋体门。PCR-DGGE图谱泳道相似性分析及主成分分析(PCoA)显示婴幼龄组和孕期组聚类明显。Q-PCR结果显示梭菌属细菌和双歧杆菌最为丰富,肠球菌属最少。梭菌属clustersⅪⅤ,肠球菌属和拟杆菌-普氏菌属组间差异明显(P<0.01)。作为显示肠道健康水平标准的双歧杆菌和肠杆菌比值(B/E值)与同龄恒河猴相比,在孕期恒河猴组有明显的降低(P<0.01)。婴幼龄组和孕期组特点相似属首次发现。

中国恒河猴(Macaca mulatta)外周血Th17细胞及其在SHIV感染后的变化

目的:对正常中国恒河猴(Macaca mulatta)及嵌合猿猴/人免疫缺陷病毒(SHIV)感染过的中国恒河猴外周血中CD4+IL-17A+和CD4-IL-17A+T淋巴细胞的分布频率进行初步观察。方法:用荧光染料标记的单克隆抗体(mAb)对10只中国恒河猴的外周血或PMA+Ionomycin刺激后的PBMC细胞表面的CD3、CD4、CD8及细胞内IL-17A进行免疫荧光染色。用FACScalibaur获取染色后的样品,所得数据用CellQuest进行分析。结果:在6只正常中国恒河猴个体中均能检测到IL-17A+淋巴细胞,未经刺激培养的样品中IL-17A+细胞频率很低,但在短期刺激培养后淋巴细胞中具有约1.4%的淋巴细胞为IL-17A+细胞,明显多于刺激前的IL-17A+淋巴细胞;在短期刺激培养后CD3+CD4+淋巴细胞中大约有2.7%的IL-17A+细胞或CD4+Th17细胞。对4只SHIV感染个体中Th17细胞的初步分析未发现它们与正常个体间的统计学差异。结论:与人类相似,中国恒河猴的外周血中也存在一定比例的Th17细胞,为进一步利用恒河猴AIDS动物模型分析HIV/AIDS与Th17细胞的关系提供了基础。

中国恒河猴MHC Ⅰ型部分等位基因的分析

目的对中国恒河猴主要组织相容性复合体(MHC)I型部分基因进行携带情况调查与分析。方法采用序列特异性引物(PCR-SSP)分型方法对华南灵长类动物研究中心繁殖的30只谱系清晰的中国恒河猴(Macacamulatta)的32个MHC I型分子位点进行检测。结果采用的32对引物中,中国恒河猴可检出携带23个MHC I等位基因,但基因携带频率存在很大的差异,由3.57%至82.14%不等。结合遗传谱系分析,判断A1*21和A2*05之间以及B*04和B*30之间可能就是连锁的。结论中国恒河猴携带能控制病毒复制的MHC I型基因位点的频率较高,其基因携带频率与已发表的印度恒河猴携带频率存在明显差异。本研究为促进中国恒河猴在AIDS研究中的应用,以及为建立携带特定MHC I基因实验猴小种群提供了依据。

免疫缺陷病毒感染的中国恒河猴骨特异性碱性磷酸酶和甲状旁腺激素的动态变化

目的监测中国恒河猴在感染猴免疫缺陷病毒(SIV)前后骨特异性碱性磷酸酶(BAP)和甲状旁腺激素(PTH)水平的动态变化,探讨艾滋病毒对骨代谢的影响及可能机制。方法 20只中国恒河猴感染SIVmac239,分别在感染前和感染后2、6、9、12、15和18个月空腹静脉采血,检测病毒载量、CD4^+细胞及血浆BAP和PTH水平。结果中国恒河猴感染SIV后,BAP水平持续下降,在12～18个月时最为明显(P<0.01);PTH水平在感染早期(2个月)略下降,后期出现上升趋势。结论中国恒河猴免疫缺陷病毒感染可直接或间接累及骨代谢系统,表现为骨形成下降,甲状旁腺轴功能受损可能是其危险因素之一。

中国恒河猴(Macaca mulatta)外周血CD4^+CD25^+T淋巴细胞的研究

目的:研究中国恒河猴外周血中CD4+CD25+T淋巴细胞亚群及其分布频率。方法:利用流式细胞术对50只中国恒河猴外周血CD4+CD25+T淋巴细胞进行了分析。结果:发现所有被检测的恒河猴个体中均存在明显的CD4+CD25+T淋巴细胞亚群;CD4+CD25+T淋巴细胞大约占CD4+T淋巴细胞的9.1%(变化范围为2.6%～18.1%);其中CD4+CD25highT淋巴细胞约占2.5%(0.3%～5.5%)。对不同年龄和性别个体中CD4+CD25+T淋巴细胞频率的初步分析未发现统计学上有年龄或性别差异。结论:中国恒河猴可用于与CD4+CD25+T细胞相关的人类疾病的研究中。

SHIV1157ipd3N4中国恒河猴细胞适应株静脉感染中国恒河猴有效浓度的确定

目的确定SHIV1157ipd3N4静脉途径感染中国恒河猴的有效病毒浓度,明确SHIV1157ipd3N4感染实验猴体内病毒复制和免疫损伤情况。方法 10只正常中国恒河猴分成6组,分别用10倍系列稀释的病毒液1 mL静脉感染,测定血浆病毒载量,CD4+/CD8+,CD4+T淋巴细胞绝对数,分析感染后恒河猴体内病毒复制和免疫损伤情况。结果 5TCID50/mL以上浓度的SHIV1157ipd3N4能通过静脉途径感染中国恒河猴。结论该实验的成功进行为SHIV/中国恒河猴疾病及评价模型的建立奠定了良好的基础,为今后使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。

SIVmac239毒株经静脉及直肠感染中国恒河猴的比较

目的研究猴免疫缺陷病毒SIVmac239毒株经静脉及直肠途径感染中国恒河猴后的生物学特性和症状表现，并比较由感染途径不同导致的差异，为该模型系统的应用提供依据。方法以SIVmac239毒株经静脉感染19只中国恒河猴，经直肠感染6只中国恒河猴，观察至感染后232或168d，比较其抗猴免疫缺陷病毒（SIV）特异性抗体滴度、CD4＋T细胞数量、血浆病毒载量、淋巴结病理改变以及临床表现的变化。结果所有猴均出现SIV抗体阳转。在静脉感染猴，感染后10d检测到SIV特异的IgM，而直肠感染猴始终未能检测到。在感染后168d，静脉感染猴的SIV特异性IgG的平均水平较直肠感染猴高10倍。在观察期内，直肠感染组的CIM＋T细胞数下降不如静脉感染组显著。所有猴的血浆SIV载量均在感染后10—14d达到高峰（10^7拷贝／ml左右），约2个月后降至平台期（10^3-10^4拷贝／ml）。2只静脉感染猴及1只直肠感染猴在感染后150—210d死于猴免疫缺陷综合征，呈快速进展型改变。结论 SIVmac239毒株静脉及直肠感染接种中国恒河猴，均可建立慢性的SIV感染，其特征与人感染人类免疫缺陷病毒后的改变相似，均可以作为良好的研究获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的动物模型，尤其有助于预防性或治疗性AIDS疫苗的研究。

CXCR4嗜性SHIVKU-1病毒静脉感染中国恒河猴初步研究

目的了解SHIVKU-1静脉途径感染中国恒河猴的感染特点及进展规律。方法两只健康中国恒河猴,静脉感染SHIVKU-1病毒,定期采样检测血浆病毒载量、CD4+/CD8+比值、CD4+T细胞绝对数变化和血清中抗SHIVKU-1特异性IgG抗体水平。多色流式技术分析外周血、腹股沟淋巴结和十二指肠粘膜固有层CD4+T淋巴细胞记忆细胞亚群变化。结果两只实验猴成功感染SHIVKU-1病毒,一直到感染后3个月均保持稳定水平的病毒载量。外周血CD4+T淋巴细胞下降明显,CD4+/CD8+T细胞比值严重倒置。CD4+Tcm细胞比例在经历了感染早期的下降后,大幅升高,尤其是外周血和淋巴结。CD4+Tem则在粘膜固有层中增加明显。结论 SHIVKU-1静脉途径成功感染了中国恒河猴,为SHIV/中国恒河猴疾病及评价模型的建立奠定了良好的基础,为今后使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。

中国恒河猴DNGR-1分子C型凝集素样结构域在大肠杆菌系统表达

目的获得恒河猴C型凝集素结构域家族9的A成员(Clec9A)基因编码区序列;体外表达CLEC9A的C型凝集素样结构域(CTLD)。方法利用Clec9A基因特异引物,反转录PCR扩增中国恒河猴Clec9A基因编码区,亚克隆至pGEM-T载体,获得pGEM-T-DNGR质粒并进行测序。构建CLEC9A分子的CTLD区原核表达质粒pET-32a-CTLD,转化BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,并用SDS-PAGE和Western blot法对目的蛋白进行鉴定。结果 PCR扩增得到726 bp的Clec9A编码区全长,测序和序列比对发现恒河猴CLEC9A编码区的核苷酸序列与人和小鼠的同源性分别为95.0%和73.1%,推测的氨基酸同源性分别为91.7%和57.3%。体外表达获得相对分子质量(Mr)约32 000的CTLD融合蛋白,Western blot方法鉴定发现其与人DNGR-1分子具有相似的抗原性。结论中国恒河猴Clec9A基因与人的高度相似并能编码与人CTLD抗原性相似的蛋白。

SHIV-KB9病毒中国恒河猴细胞适应株的制备

试验旨在研究体外制备SHIV-KB9病毒中国恒河猴细胞适应株,在细胞水平和中国恒河猴体内评价其生物学特性。试验将SHIV-KB9半长质粒连接后转染CEMx174细胞,转染上清与正常恒河猴PBMCs共培养。定期测定培养液中的P27抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存,测定病毒RNA载量和TCID50。静脉感染中国恒河猴,研究该批次SHIV-KB9在体内的病毒学、免疫学指标变化及变异情况,分析其基本的生物学特性。结果表明,本研究共制备了95mLSHIV-KB9病毒原液,病毒载量为2.678×105拷贝/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为3.16×103/mL,gp120序列分析表明病毒未发生变异。10倍稀释的3个不同浓度的SHIV-KB9均静脉成功感染中国恒河猴,引起外周血CD4+/CD8+大幅下降。因此,此次制备的SHIV-KB9细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库建立SHIV-KB9/中国恒河猴模型。

抗人B淋巴细胞单克隆抗体清除中国恒河猴体内B淋巴细胞效果观察

目的用抗人B淋巴细胞单克隆抗体(利妥昔单抗注射液,Rituximab)通过静脉滴注的方法敲除中国恒河猴体内B淋巴细胞,并观察其敲除效果,为建立B淋巴细胞缺失的恒河猴动物模型提供基础的实验数据。方法选取健康的中国恒河猴两只,静脉滴注抗人B淋巴细胞单克隆抗体,定期采集外周血、腹股沟淋巴结和十二指肠黏膜组织,制备淋巴细胞悬液,应用流式细胞术的方法系统性测定B淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的变化。结果静脉滴注利妥昔单抗注射液后24 h,中国恒河猴外周血中B淋巴细胞的缺失即能达到100%,持续约14 d;腹股沟淋巴结中B淋巴细胞在静注后7 d缺失100%;十二指肠黏膜组织中B淋巴细胞在静脉滴注后7 d缺失达到90%,维持28 d。并且在成功敲除B淋巴细胞的情况下,CD4+T及CD8+T淋巴细胞无明显波动,维持在一个稳定的水平。结论利妥昔单抗注射液能有效去除中国恒河猴体内B淋巴细胞,为建立B淋巴细胞缺失动物模型奠定基础。

中国恒河猴外周血淋巴细胞免疫表型及功能研究

目的通过研究中国恒河猴外周血淋巴细胞免疫表型及其功能,为以恒河猴为模型的研究提供数据参考。方法通过优选抗体克隆和荧光配色,确定了主要淋巴细胞亚群检测和T细胞功能检测Panel,并用此方法分析15只健康中国恒河猴外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中T、B、NK等多种细胞亚群的比例,以及在非特异性刺激条件下T细胞分泌细胞因子的能力。结果成功建立了两套多色流式Panel,Panel 1可同时检测细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocyte,CTL)、滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell,Tfh)、调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)、B细胞和NK细胞等多种淋巴细胞亚群,Panel 2可检测多种T细胞亚群功能和免疫检查点分子的表达。中国恒河猴PBMCs中主要淋巴细胞亚群比例的平均值分别为T细胞(75.32±7.73)%、B细胞(13.22±7.50)%、NK细胞(0.88±0.48)%、Tfh细胞(0.73±0.27)%、Treg细胞(0.75±0.43)%、CD16+NK细胞(47.87±22.35)%、CD56+NK细胞(10.69±12.41)%。非特异性刺激后,分泌IL-2和TNF-α的CD4+T细胞比例高于CD8+T细胞,分泌CD107a和IFN-γ的CD8+T细胞比例高于CD4+T细胞,而这两种细胞分泌IL-17A的比例均较低。结论本研究建立了可在单细胞水平同时检测多个细胞表面分子和分泌因子的多色流式检测方案,能够准确、全面地分析恒河猴PBMCs中免疫细胞亚群、免疫功能以及免疫检查点分子的表达,为利用恒河猴模型进行传染病疫苗及药物研发提供新的实验方法和基础数据。

青蒿琥酯对猴免疫缺陷病毒感染中国恒河猴模型T淋巴细胞活化的调节作用

目的:观察注射用青蒿琥酯对猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)感染中国恒河猴模型免疫异常激活的改善情况,探讨青蒿琥酯对艾滋病的干预作用。方法:选用8只SIV感染平台期中国恒河猴模型,随机分为治疗组和对照组,每组各4只,治疗组按每天3 mg·kg^(-1)剂量肌肉注射青蒿琥酯注射液8周,对照组肌肉注射等剂量生理盐水。分别于给药前,给药后2周、4周、6周、8周,停药后4周、8周检测血浆病毒载量、全血细胞计数、淋巴细胞亚群及免疫活化相关标记物CD_(69)^+、CD_(25)^+、HLA-DR^+和CD_(38)^+表达情况。结果:青蒿琥酯可在4周内下调CD_8^+细胞CD_(69)^+、HLA-DR^+和CD_(38)^+表达水平(P<0.05),对CD_4^+细胞影响较小。给药第4周出现一过性嗜中性粒细胞下降,后回升至正常水平。结论:青蒿琥酯可改善SIV感染中国恒河猴细胞毒性T细胞免疫异常激活,嗜中性粒细胞下降是可逆的。

SIVmac251感染中国恒河猴外周血免疫学及病毒学指标动态变化

目的观察中国恒河猴感染猴免疫缺陷病毒（simianimmunodeficiencyvirus，sIV）后病毒学和免疫学基本指标的变化规律，探讨中国恒河猴用于艾滋病模型时外周血白细胞（WBC）和CD4＋T细胞比例的标准。方法以SIVmac251感染36只中国恒河猴，于感染前1天及感染后1—8周每周及感染后第10周分别采集外周静脉血，检测血常规、外周血淋巴细胞亚群和病毒载量。结果除WBC计数变化不显著外，其余检测指标均在感染后第1、2周时变化最为剧烈；WBC计数在（4—10）×10^6个／ml之间结合外周血CD4＋T细胞比例高于25％的可作为艾滋病模型的选猴标准。结论为应用中国恒河猴进行艾滋病研究提供了有益的信息。

中国恒河猴SIV急性感染期模型CD4细胞和MBL的变化

目的研究中国恒河猴猴免疫缺陷病毒(SIV)mac239急性期感染模型外,周血CD4+T淋巴细胞(简称CD4细胞)、淋巴结CD4细胞和血清甘露糖结合凝集素(MBL)的变化情况,探索感染早期固有免疫与适应性免疫的病理变化。方法选用5只健康中国恒河猴,静脉接种SIVmac239病毒株,分别于感染前、感染后2周、4周和10周检测血常规、血浆病毒载量,流式细胞仪分析外周血淋巴细胞亚群,免疫组织化学染色法观察淋巴结CD4细胞,酶联免疫吸附试验法检测血清MBL。结果感染后CD4细胞比值较感染前降低27.3%(P<0.05),CD8细胞比值较感染前升高44.3%(P<0.05),外周血CD4细胞绝对数下降23.6%,淋巴结CD4细胞上升14.9%,但是差异无统计学意义。血清MBL在感染后10周内持续下降至感染前水平的24.5%(P<0.01)。结论 SIV急性感染期固有免疫破坏显著,适应性免疫主要表现为体液免疫与细胞免疫的失衡。

SHIV_(SF162P3)中国恒河猴细胞适应株的制备和鉴定

目的体外制备SHIVSF162P3中国恒河猴细胞适应株,建立病毒库,为模型制备提供生物学特性稳定的感染用病毒。方法用SHIVSF162P3体外感染中国恒河猴外周血单个核细胞(PBMCs),定期测定培养液中的P24抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存。测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50。利用病毒RNAenv区(M33262,6846bp～8481bp,共1636bp)序列分析的方法分析毒株在制备过程中的变异情况。静脉途径感染中国恒河猴G0801V,观察血浆病毒载量、外周血CD4+/CD8的变化情况。结果本研究共制备了275mLSHIVSF162P3病毒,病毒载量为4.389×107copies/mL,P24抗原水平为5.64×102pg/mL,TZM-bl细胞滴定TCID50为8.37×104/mL。gp120序列测定分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变。感染猴G0801V高峰期病毒载量超过1×108copies/mL,急性期CD4+/CD8+倒置。结论此次制备的SHIVSF162P3细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIVSF162P3/中国恒河猴模型。