辽东湾中国明对虾增殖放流回顾与思考

在过去的几十年中,过度捕捞、水体污染等人为干扰因素已致使世界上许多国家的近海渔业资源出现了严重衰退迹象[1],我国近海渔业资源也已严重衰退,渔业资源持续下降[2-3].中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)隶属于甲壳纲十足目对虾科明对虾属,是一年生暖水性长距离洄游大型虾类,主要分布于黄海、渤海和朝鲜半岛西海岸[4].

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞中一氧化氮合成酶的鉴定及其在白斑综合症病毒感染过程中的变化

诱导型一氧化氮合成酶 (iNOS)在生物机体免疫 ,特别在无脊椎动物免疫中的作用近来得到了广泛的关注 ,由其催化产生的一氧化氮 (NO)除具有已知的神经传导、松弛平滑肌等功能外 ,还具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫等作用。作者通过硝基四氮唑蓝 (NBT)法和血细胞形态观察等方法 ,对中国明对虾 (Fenneropenaeuschinensis)血细胞中存在的诱导型一氧化氮合成酶进行了初步鉴定。在此基础上 ,通过亚硝酸盐法和L 瓜氨酸法对比 ,研究了感染白斑综合症病毒 (WSSV)后中国明对虾血细胞中一氧化氮合成酶的变化情况。结果显示 ,中国明对虾在感染WSSV后 ,iNOS活性在 1 2h内有上升趋势 ,实验 36h后酶活性显著下降 ,至 60h后酶活性降至对照组的一半左右。同时 ,被脂多糖 (LPS)诱导的一氧化氮合成酶活性与对照相比也有显著下降。与此对应的是 ,核酸探针斑点杂交法检测病毒的结果显示 :实验 36h后在对虾体内能够检测到白斑综合症病毒。对照组中国明对虾血细胞的iNOS在实验过程中基本保持稳定。这说明WSSV在感染中国明对虾初期可以诱导血细胞产生iNOS ,但随着WSSV在中国明对虾体内的大量增殖及其对血细胞的破坏 ,使得iNOS活性显著降低 ,对虾也趋于死亡。因此 。

SDS-PAGE与液质联用技术分离和鉴定中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血浆蛋白

提取中国明对虾的血浆蛋白用SDS-PAGE进行分离。将电泳条带从上到下平均切成4份,分别胶内酶解并利用液相色谱-串联质谱系统进行质谱分析。利用SEQUEST软件对NCBInr蛋白数据库进行检索,鉴定了66个中国明对虾血浆蛋白质。运用生物信息学手段,对鉴定的蛋白进行功能分类,包括转录、细胞结构和骨架、信号转导、蛋白质合成与处理、蛋白质折叠、分拣和降解、免疫功能、生长和发育、能量代谢、细胞周期、碳水化合物代谢、钙离子平衡、抗氧化剂和氨基酸和脂类代谢等。本研究丰富了中国对虾血浆蛋白质表达谱,可为进一步研究对虾免疫机制提供有力的支持。

生存密度和饵料对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)争胜行为和生长性能的影响

为探讨生存密度和饵料对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)争胜行为和生长性能的影响,实验采用中国明对虾仔虾为材料,设置300尾/m2(DL)、600尾/m2(DA)、1200尾/m2(DH)3个密度梯度,鲜活卤虫和人工配合饵料2种饵料及饱喂(FF)、少喂(LF)、不喂(NF)3个投喂丰度,测定中国明对虾的体长增长、存活率,以及投喂前、投喂时、投喂后对虾之间的争斗行为等指标。结果表明,仔虾间的争胜行为随生存密度的升高而增加,生长和存活率逐渐降低;饵料种类和丰度能显著影响中国明对虾的争胜行为和生长性能(P<0.05)。结果显示,生存密度、饵料种类及丰度会影响中国明对虾的争胜行为,投喂鲜活饵料有利于提高存活率和生长速度。

磺胺二甲嘧啶对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)非特异性免疫酶活性的影响

以50、100和150 mg/kg磺胺二甲嘧啶连续投喂中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)5 d,于给药期间第1、2、3、4、5天及停止投喂药物的第1、2、3、4、5、7、10天取样,测定中国明对虾免疫相关指标超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)和酚氧化酶(PO)活性的变化情况。结果显示,磺胺二甲嘧啶不同给药剂量对酶活性的作用效果不同,投喂渔药期间(0–5 d),低浓度组SOD和PO活性均极显著高于对照组(P<0.01);AKP活性于投药第2、3天极显著低于对照组(P<0.01),随后逐渐升高,于第5天显著高于对照组(P<0.05);LZM活性于投药第3、4天显著低于对照组(P<0.05),于第5天极显著低于对照组(P<0.01)。中浓度组SOD活性在前2 d显著高于对照组(P<0.05),投药3、4 d显著低于对照组(P<0.05);AKP活性于第5天活性最高,为对照组的1.14倍;LZM活性在3、4、5 d显著低于对照组(P<0.05);PO活性在投喂药物前期1–3 d呈上升趋势,极显著高于对照组(P<0.01),于第3天达到最高值。高浓度组SOD和LZM活性在投药期间显著低于对照组(P<0.05);AKP活性于投药期间显著高于对照组(P<0.05);PO活性于1、2 d极显著高于对照组(P<0.01),随后逐渐下降。停止投喂药物阶段(6–15 d),3个浓度组各免疫相关指标均恢复至对照组水平。研究表明,低浓度磺胺二甲嘧啶对中国明对虾的免疫机能具有一定的影响,高浓度磺胺二甲嘧啶对中国明对虾的免疫机能具有明显的抑制作用。在使用抗菌药物进行抑菌或杀菌的同时,要综合考虑所选择给药剂量对对虾生理机能的影响。

氨氮胁迫下中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶基因的表达分析

采用RACE技术克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶GDH基因(Fc GDH)。Fc GDH基因全长1779 bp,包括1个1659 bp的开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸,预测分子量大小为61.3 k Da,理论等电点为6.54。同源性分析显示,Fc GDH氨基酸序列与其他动物高度保守,其中,与凡纳滨对虾最为相似,高达98%,其次为中华绒螯蟹,为89%。系统进化树分析显示,Fc GDH氨基酸序列与凡纳滨对虾GDH聚为一支,之后依次为:中华绒螯蟹、黑腹果蝇、埃及按蚊。组织表达分析发现,Fc GDH基因在肌肉、鳃、肝胰腺、胃、肠、淋巴和血淋巴中均有表达,其中,肌肉中表达量最高。氨氮胁迫后,Fc GDH基因在肌肉和肝胰腺组织中变化显著,在胁迫后期,Fc GDH基因表达量均上调,且与对照组相比差异显著(P<0.05),说明Fc GDH基因在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用。

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)外部性征的分化及发育

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的性别分化和生殖器官发育是其繁殖生物学的重要部分,也是进行性别调控的基础。经过2年的取样观察,研究了中国明对虾雌性纳精囊和雄性交接器的分化与发育过程。结果显示,早在仔虾后16 d(16 days post-larva,PL16)即开始雌雄分化,此时,雌虾第4与第5对步足间腹甲处的锥突出现明显下陷,而雄虾的没有下陷。PL54时,雌虾纳精囊瓣膜出现,然后继续发育,到PL124时形成纳精囊雏形;雄虾交接器发育较晚,到PL54时,雄虾第1泳足的内肢才出现分化,在PL106基本形成雄性交接器。

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)肠道微生物区系组成的分子分析

中国明对虾主要分布在我国黄渤海和朝鲜西部沿海，南海部分海域也有少量存在，是我国重要的海水养殖对虾之一。中国明对虾是中国的特产，也是重要的出口水产品，无论是品质还是市场价格都远远高于其他养殖对虾品种，其最高养殖年产量曾达到近20万吨。

灭活鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血液抗菌活性的变化

采用对中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)人工注射灭活鳗弧菌,利用溶壁微球菌(Micrococcusluteus)和鳗弧菌(Vibrioanguillarum)作为测试菌株,对在抑菌活性检测中最为常用的抑菌圈法、辐射扩散法和液体培养基微量稀释检测法进行了技术改进并比较了它们的检测效果,并检测了阳离子交换柱层析法初步分离的中国明对虾血淋巴主要组分的抗菌活性,进行了细菌攻毒前后中国明对虾血浆及血细胞抗菌活性变化的研究。结果表明,液体培养基微量稀释检测法抑菌效果在三种方法中灵敏度最高,抑菌圈法灵敏度最低,但对于蛋白含量较高的样品,辐射扩散法被证明在抑菌活性检测方面更为适用。利用改进的辐射扩散法对灭活鳗弧菌攻毒前后的中国明对虾血细胞和血浆的抑菌活性进行了检测,结果显示,虽然感染后血细胞数目显著降低(P<0·05),但其抑菌能力却明显增强(P<0·05),相对而言,血浆抑菌活性变化不显著(P>0·05),说明血细胞在受到免疫刺激后抗菌因子的表达进一步加强。

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)Akt/PKB基因在病原刺激下的表达和功能分析

本文在对中国明对虾转录组数据进行生物信息学分析的基础上,克隆获得了其Akt/PKB基因(FcAkt)的开放阅读框(ORF)的cDNA序列,分析了对虾FcAkt基因的结构特征,并利用实时定量RT-PCR技术分析了FcAkt基因在鳗弧菌、溶壁微球菌和白斑综合征病毒(WSSV)注射后的转录表达变化。结果表明,中国明对虾FcAkt基因的ORF全长为1536bp,编码511个氨基酸,预测蛋白分子量为58.9kDa,理论等电点pI为5.60。同源比对显示该基因的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性。进化分析发现FcAkt与地蟹、果蝇、埃及伊蚊、家蚕等节肢动物的蛋白激酶B(Akt/PKB)亲缘关系较近。FcAkt的转录表达在不同细菌或WSSV刺激后具有明显的变化,提示对虾FcAkt基因可能在对虾的免疫防御中发挥了重要作用。

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)coat-ε基因全长cDNA克隆及组织分布

coat-ε基因表达的蛋白是组成COPⅠ的coatomer复合体的一个亚基,为获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)coat-ε基因全长序列,采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA end,RACE)技术,扩增出coat-ε基因的3端和5端,测序结果经DNAMAN比对拼接得出coat-ε基因全长,基因全长1402 bp,5非编码区(UTR)84 bp,3'非编码区(UTR)310 bp,开放阅读框1008 bp,预测编码335个氨基酸,其中,第230–300的氨基酸属于TPR超家族,Signal P 3.0 Server预测氨基酸序列没有信号肽,TMHMM Server v.2.0分析此氨基酸不存在跨膜结构,PSORTⅡPrediction预测该蛋白位于线粒体、细胞质、内质网中,属胞内蛋白。系统进化树显示,中国明对虾的coat-ε基因与节肢动物门的动物亲缘关系相近。采用实时荧光定量方法分析该基因在鳃、上皮、胃、肌肉、肝胰腺等不同组织中的相对表达,结果显示,coat-ε在肌肉中的相对转录表达量最高,在鳃和附肢的表达次之。本研究获得的中国明对虾coat-ε全长序列,可为该基因功能研究提供基础。

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和凡纳滨对虾(Litopenaeus.vanna mei)血清酚氧化物酶活性的研究

研究了中国明对虾和凡纳滨对虾血清酚氧化酶 (PO)的生理功能和活性影响。结果表明 ,中国明对虾和凡纳滨对虾血清中都存在PO ,主要以酚氧化酶原 (proPO)的形式存在 ,并且都可以被可以被胰蛋白酶、SDS和酵母聚糖激活。抗凝剂SSS(ShrimpSaltSolution)会影响中国明对虾和凡纳滨对虾血清中的PO活性引起PO活性的降低。正常状态下中国明对虾血清中PO活性较凡纳滨对虾血清PO活性低。中国明对虾血清PO最适温度为 5 0℃ ,最适 pH为 8.5 ,而凡纳滨对虾PO最适温度为 4 5℃ ,最适 pH为 7.5。

聚β-羟基丁酸酯对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)非特异性免疫相关酶的影响

本研究以中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)为对象,探讨不同浓度的聚β-羟基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate,PHB)对其非特异性免疫相关酶的影响。实验采用单因子浓度梯度法,对健康的中国明对虾投喂添加不同浓度PHB(0、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%)的饲料,分别对应对照组C和实验组E_(0.5)、E_(1.0)、E_(2.5)、E_(5.0)、E_(10.0)组,饲喂6周,统计每组中国明对虾的死亡率和相对免疫保护率,检测总抗氧化能力(T-AOC)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)5种酶的活力及丙二醛(MDA)含量与时间、PHB浓度的变化关系。结果显示,实验组的相对免疫保护率随PHB浓度的增加呈现先上升后下降的趋势。E_(1.0)组为最高值,并且与其他各组相比差异显著(P<0.05)。随PHB浓度的增加,免疫酶活力整体变化趋势为先上升后下降。在时间分布上,饲喂2–3周时,酶活力呈现高水平表达,其中,T-AOC在血清(E_(1.0)、E_(2.5)组)、肝胰腺(E1.0组);ACP在血清(E_(1.0)、E_(2.5)组)、肝胰腺(E1.0组);CAT在血清(E_(0.5)、E_(1.0)、E_(2.5)组)、肝胰腺(E_(0.5)、E_(1.0)、E_(10.0)组);POD在血清和肝胰腺(E_(0.5)、E_(1.0)、E_(2.5)组);SOD在血清和肝胰腺(E_(1.0)组)以及MDA在血清(E1.0组)、肝胰腺(E_(0.5),E_(1.0)组)较其他组均具有显著性差异(P<0.05)。研究表明,PHB添加剂对中国明对虾免疫水平的提高具有促进作用。综合各组和各时间段免疫酶的变化,E_(1.0)为最适浓度组,投喂2–3周时其免疫酶总体具有高水平活力值。

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)丝氨酸蛋白酶同源物基因(Fc-SPH)的重组表达及活性分析

以实验室前期克隆到的中国明对虾丝氨酸蛋白酶同源物基因(Fc-SPH)(GenBank登录号:DQ318859)为基础,利用原核表达系统对Fc-SPH基因成熟肽区域进行了重组表达和纯化复性分析,并对获得的重组目的蛋白开展了抑菌活性及微生物清除功能研究。结果表明:在体外成功获得了大量有活性的对虾Fc-SPH蛋白(rFc-SPH),活性研究显示rFc-SPH对大多数受试菌种都有明显的抑制效果,并可以加速中国明对虾清除体内外源微生物的速度。作者推断Fc-SPH即可以作为一线防御应答效应物直接参与虾类的先天免疫活动而发挥作用,也可以通过调理作用促进血细胞对病原微生物的吞噬和杀灭。

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)Tetraspanin-3与WSSV的体外相互作用

Tetraspanin-3是四跨膜蛋白超家族的一员,在信号转导和免疫等过程中起到重要作用。本研究将中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)Tetraspanin-3(FcT_3)的大胞外环区(Large extracellular loop,LEL)基因片段克隆,与原核表达载体p BAD/gⅢA连接,获得重组表达载体p BAD/gⅢA-T3L,转化入大肠杆菌TOP 10中,用L-阿拉伯糖(L-Arab)诱导并经钴离子亲和层析纯化得到重组蛋白。质谱分析显示,纯化的重组蛋白为FcT_3。用地高辛将FcT_3L标记并与WSSV作用,Far-western分析显示,FcT_3L与VP26结合。ELISA实验结果显示,FcT_3L与VP26蛋白的相互作用随VP26量的增加而增强。推测FcT_3通过与VP26作用介导病毒核衣壳的入胞过程。

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)类围食膜蛋白基因克隆及其在WSSV感染中的表达

为了揭示围食膜蛋白在对虾免疫中的作用,从中国明对虾中获得类围食膜蛋白FcPT2的部分基因序列,将之与其他昆虫的CPAP3氨基酸序列进行比对和系统进化分析,用实时定量PCR方法检测FcPT2在中国明对虾不同部位的表达情况,观察WSSV感染前后中国明对虾FcPT2表达的变化.中国明对虾FcPT2编码的蛋白中含有3个典型的ChtBD2结构域.通过NCBI Blast软件对所得基因编码的氨基酸序列进行在线搜索,发现FcPT2与昆虫的围食膜蛋白TcCPAP3-D2、ApCPAP3-D2和NvCPAP3-D2具有较高相似性.系统进化树分析结果表明,FcPT2与CPAP3围食膜蛋白聚在一起,也说明FcPT2与昆虫的CPAP3围食膜蛋白具有相对较高的序列相似性.FcPT2主要在中国明对虾的眼柄和胃组织中进行表达,中国明对虾感染WSSV后,FcPT2在胃组织中的表达显著上调.由此认为,FcPT2可能在中国明对虾应答WSSV侵染中发挥了重要作用.

中国明对虾放流对鱼类生态位的影响

为探究中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)增殖放流对水域内鱼类的影响及其表现形式,采用原位实验生态学方法,在对虾放流河道构建围隔,设置3种虾苗放流量(模拟莱州湾近岸放流5亿尾、7.5亿尾和10亿尾)和无放流处理,经过一个对虾生长季后,比较不同处理围隔中鱼类组成和生态位特征差异。结果显示,4种处理围隔中,回捕对虾数量随放流量增加而增加,但其生物量、平均个体大小和回捕率未随放流量增加而增加;回捕率在放流围隔间差异显著,以5亿尾模拟围隔的值最高;鱼的种类组成相似,可归于杂食性、浮游动物食性和鱼/虾食性。总鱼类和鱼/虾食性的鱼类产出量在围隔间差异不显著,杂食性鱼的产出量以放流围隔较高,浮游动物食性鱼的产出量随对虾放流量增加而减少。鱼种间高生态位重叠(>0.75)配对数随对虾生物量增多而减少。相似性分析显示,放流最多的和无放流围隔的鱼类生态位相异程度最高。综上认为,在实验水体中,放流对虾并不降低鱼类总量产出,但可能会影响不同食性鱼类的相对组成和生态位重叠度,且影响效应随放流量增加更为明显。

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)卵黄发生前期与消退期卵巢和肝胰腺消减文库的初步构建及分析

利用抑制性消减杂交技术(SSH)分别对中国明对虾在卵黄发生的两个关键时期(卵黄发生前期和消退期)构建卵巢和肝胰腺的正反向消减文库,测序结果与GenBank进行BLASTx同源比较并利用GO分析进行功能注释。结果显示,各文库中的差异表达基因与卵巢发育时期相吻合,卵黄发生前期的卵巢和肝胰腺中分别检测到与卵黄蛋白原相关基因的出现,说明卵黄发生前期与卵黄发生有重要联系。在消退期中检测到与皮质棒形成相关的基因,说明消退期仍有皮质棒的形成,同时也检测到一些与免疫相关的基因,在机体中差异表达时期的功能有待进一步探讨。

中国明对虾BMP-7基因的克隆及表达模式分析

为探明转化生长因子-β (TGF-β)超蛋白家族的成员之一骨形态发生蛋白7 (BMP-7)基因在中国明对虾肌肉发生和生长过程中的表达模式,通过cDNA末端快速扩增技术得到了中国明对虾BMP-7基因(FcBMP-7基因)2003 bp的全长cDNA,包含466 bp的5′非翻译区和295 bp的3′非翻译区,1242 bp的开放阅读框共编码413个氨基酸。利用实时荧光定量PCR技术分析FcBMP-7基因在中国明对虾幼体原肠期、无节幼体期、溞状幼体期、糠虾幼体期、仔虾期5个不同发育时期肌肉组织中的表达规律,结果显示,该基因在幼体发育的各时期均有表达,原肠期表达量最低,从无节幼体期开始表达量显著增加(P<0.05),糠虾期表达水平最高,表明FcBMP-7基因参与了幼体肌肉的发生过程。此外,进一步分析FcBMP-7基因在中国明对虾2种规格幼虾[(3.95±0.08) g和(1.55±0.12) g]的8种组织中的表达模式,结果显示,FcBMP-7基因具有组织表达广泛性,且两组间的大部分组织的表达量均存在显著差异(P<0.05)。试验结果表明,FcBMP-7基因可能作为调节因子参与了中国明对虾幼体肌肉发生和幼虾肌肉生长过程,研究结果可为进一步解析中国明对虾肌肉发生发育的分子机制提供重要的理论资料。

不同性别中国明对虾形态性状与体质量的关系

为探明不同性别中国明对虾形态性状对体质量的影响,选择中国明对虾雌、雄各158尾,对其体长(x1)、额角长(x2)、头胸甲长(x3)、头胸甲宽(x4)、腹节长(x5)、尾节长(x6)、第1触角外鞭长(x7)、第1触角内鞭长(x8)、第2触鞭长(x9)、额角上齿数(x10)、额角下齿数(x11)和体质量(y)进行测定,采用多元回归分析和通径分析的方法,对中国明对虾各形态性状与体质量的关系及影响进行分析。试验结果显示:从形态性状与体质量的相关性来看,雌、雄群体中体长与体质量的相关性均最大,分别为0.885、0.869,雌性群体除额角上齿数外,其他形态性状与体质量显著或极显著正相关;雄性群体除额角上齿数和额角下齿数外,其他形态性状与体质量极显著正相关。在雌、雄群体中,体长对体质量直接作用均最大,两者通径系数分别为0.673、0.401。间接作用方面:在雌性中国明对虾群体中,体长与腹节长通过其他形态性状对体质量的间接作用较大,分别为1.897、1.528;在雄性中国明对虾群体中,体长通过其他形态性状对体质量的间接作用最大,为2.159。对雌性群体体质量起较大决定作用的形态性状为体长、第1触角外鞭长、腹节长和额角下齿数,而对雄性群体体质量决定作用较大的形态性状为体长、头胸甲长和第2触鞭长。以形态性状为自变量,体质量为因变量建立不同性别中国明对虾的回归方程,雌、雄虾分别为y1=-82.999+3.644x1+4.992x5+1.208x7+2.126x11(r2=0.927)、y2=-46.347+3.757x1+1.189x3+0.143x9(r2=0.896)。