中国棉铃虫核型多角体病毒不同基因型的虫体克隆

首次利用虫体克隆技术，对野生型中国棉铃虫核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶＷ）的不同基因型进行了分离纯化。以较低浓度的ＨａＳＮＰＶＷ感染三龄初中国棉铃虫幼虫，病毒致死幼虫单虫收集，分别提取相应的病毒核酸，进行限制性内切酶分析，得到了ＨａＳＮＰＶ的七个不同基因型（ＨａＳＮＰＶＧ１至Ｇ７），其ＥｃｏＲＩ酶切图谱均不相同。用ＢａｍＨＩ酶切分析，七个基因型的酶切图谱只在一个片段上有显著区别：Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４ＤＮＡ的ＢａｍＨＩｈ片段大小是３．３０ｋｂ，Ｇ５、Ｇ６的这一片段的大小为３．５ｋｂ，而Ｇ７的这一片段为２．７ｋｂ。结果表明，野生型ＨａＳＮＰＶ至少包含七个不同的基因型。

中国棉铃虫核多角体病毒VHA273毒株DNA的特性

VHA273毒株纯多角体经碱解、酶解及饱和酚一步法和二步法抽提的基因组,具有典型的DNA吸收光谱。吲哚法亦确证为DNA,无RNA。超离心沉降分析,扫描出主峰沉降常数为26S,次峰9.7S。热变性温度法测得Tm=89.6℃,计算(G+C)％=49.53。电镜观察DNA呈3种典型形态。大的闭环DNA平均长度29.8μ,计算得分子量是61.7×10~6;有少量极小闭环DNA存在。0.7％琼脂糖凝胶电泳显示,DNA主带清晰浓重,发现还有5条微弱次带,约2.5～3.7kb。该DNA用4种限制性核酸内切酶Bg1 Ⅱ、BamHⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ分别酶切成11、8、14和13条带。用片段积加法求出的分子量彼此很接近,平均为67.0×10~6道尔顿。酶切图谱显示,5条弱带对4种内切酶概不敏感。

中国棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒gp^(37)基因的序列分析

昆虫杆状病毒的 gp37基因与昆虫痘病毒纺锤体蛋白 (fusolin)基因具有较高的同源性。本研究通过末端测序法和引物步移法双向测定了中国棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒 (HaSNPV)gp37基因的核苷酸全序列。HaSNPV的 gp37基因开放阅读框为 84 0个核苷酸 ,共编码 2 79个氨基酸 ,预计蛋白质分子量为 31kDa。在 gp37基因起始密码子上游有一典型的杆状病毒晚期转录启动子结构GTAAG和两个TATAboxes。HaSNPVGP37前 18个氨基酸有很强的疏水性 ,可能是分泌信号肽序列。 16种GP37/Fusolin的氨基酸序列同源性比较分析表明 ,HaSNPVGP37与其它gp37基因的同源性较高 ( 4 0 60 % ) ,与痘病毒的Fusolin的同源性达 30 % 4 0 %左右。这些蛋白有 5个高度保守区 ,预计这 5个保守区为GP37/Fusolin的功能区。

中国棉铃虫多粒包埋型核多角体病毒几丁质酶基因的研究

中国棉铃虫多粒包埋型核多角体病毒VHA273毒株的几丁质酶基因的开放阅读框大小为1713bp,编码570个氨基酸残基,分子量约60kDa.氨基酸序列分析显示,杆状病毒与原核生物特别是细菌的几丁质酶具高度同源性,暗示杆状病毒的几丁质酶基因与细菌的几丁质酶基因有更为接近的进化关系,可能源于共同的祖先.

中国棉铃虫单粒包埋核多角体病毒(HaSNPV)HindⅢ-Ⅰ片段的序列分析与基因排列研究

对中国棉铃虫单粒包埋核多角体病毒 (HaSNPV)基因组中的HindⅢ Ⅰ片段的序列进行分析 ,该片段全长75 0 1nt,包括 10个开放阅读框 :AcMNPVORF111的同源基因 (Ac111) ,晚期表达因子 2 (lef 2 )基因 ,病毒核壳结构蛋白 p2 4基因、gp16 基因、多角体包膜蛋白 (polyhedronenvelopeprotein ,pep)基因、AcMNPVORF6 3的同源基因(Ac6 3) ,38 7kD基因 ,晚期表达因子 1(lef 1) 基因 ,及两个特有基因HaSNPV orf5 91和HaSNPV orf435。基因组的排列比较分析发现与AcMNPV有较大区别。

棉铃虫核多角体病毒细胞凋亡抑制基因iap3的序列分析

杆状病毒的细胞凋亡抑制蛋白在提高病毒的感染力和决定病毒的宿主域中起作用 ,具有应用于基因工程改良病毒杀虫剂杀虫特性的潜力。本研究应用末端测序法和引物步移法双向测定了中国棉铃虫核多角体病毒的iap3基因。HaSNPViap3基因的开放阅读框大小为 80 7bp ,在起始密码子上游 - 83～ - 79的位置处发现有一个晚期同源转录结构GTAAG ,在翻译终止密码子下游的 2 1～ 2 6碱基处发现有一典型的 poly (A)信号。HaSNPVIAP3蛋白的N端发现有一个典型的BIR结构和一个类BIR结构 ,C端有一个典型的RING锌指结构。对 17种IAP的排列显示 ,IAP类蛋白具有较保守的BIR结构和RING锌指结构 ,推测BIR结构内的保守氨基酸可能对其抗细胞凋亡起决定作用。

PCR介导HaNPV罹病幼虫潜伏期cDNA文库的构建

以罹病棉铃虫幼虫为材料提取总RNA ,反转录合成cDNA第一链 ,加oligo(dG)同聚尾 ,PCR扩增合成双链cDNA ,克隆到 pGEM T质粒载体中。随机筛选文库中阳性克隆 ,经酶切分析 ,cDNA插入片段大小在 0 .3～ 1.1kb之间。文库中原代重组子数为 1.66× 10 5,重组百分比为 87.8%。重组质粒的杂交分析表明 ,文库中HaNPV基因的cDNA克隆所占比例超过 50 %。