中国棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶基因的定位与克隆

以α３２ＰｄＡＴＰ标记含ＣｆＭＮＰＶ几丁质酶基因的重组质粒为探针，在６８℃条件下对棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，将ＨａＳＮＰＶ的几丁质酶基因分别定位在ＢａｍＨＩＥ、ＢｇｌⅡＥ、ＥｃｏＲＩＧ、ＨｉｎｄⅢＦ、ＸｂａＩＨ、ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＭ和ＢａｍＨＩ＋ＸｂａＩＨ，并以ｐＴＺ１９Ｒ为载体获得了ＸｂａＩＨ片段克隆。

中国棉铃虫核型多角体病毒不同基因型的虫体克隆

首次利用虫体克隆技术，对野生型中国棉铃虫核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶＷ）的不同基因型进行了分离纯化。以较低浓度的ＨａＳＮＰＶＷ感染三龄初中国棉铃虫幼虫，病毒致死幼虫单虫收集，分别提取相应的病毒核酸，进行限制性内切酶分析，得到了ＨａＳＮＰＶ的七个不同基因型（ＨａＳＮＰＶＧ１至Ｇ７），其ＥｃｏＲＩ酶切图谱均不相同。用ＢａｍＨＩ酶切分析，七个基因型的酶切图谱只在一个片段上有显著区别：Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４ＤＮＡ的ＢａｍＨＩｈ片段大小是３．３０ｋｂ，Ｇ５、Ｇ６的这一片段的大小为３．５ｋｂ，而Ｇ７的这一片段为２．７ｋｂ。结果表明，野生型ＨａＳＮＰＶ至少包含七个不同的基因型。

中国棉铃虫核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

应用谷实夜蛾核型多角体病毒（ＨｚＳＮＰＶ）ＤＮＡ聚合酶基因ＨｉｎｄⅢ／ＰｓｔⅠ３５９６ｂｐ片段作探针，经Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交，克隆了中国棉铃虫核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）完整的ＤＮＡ聚合酶基因，大小约为３．４ｋｂ。限制性内切酶分析表明，ＨａＳＮＰＶＤＮＡ聚合酶基因限制性内切酶图谱与ＨｚＳＮＰＶ相似。用双脱氧链终止法测定该基因部分核苷酸序列（８０５ｂｐ），推导出编码区２０６ａ。序列同源性比较显示，ＨａＳＮＰＶＤＮＡ聚合酶与ＨｚＳＮＰＶ之间具有高度的同源性；与ＬｄＭＮＰＶ、ＡｃＭＮＰＶ、ＢｍＳＮＰＶ。

中国棉铃虫核型多角体病毒VHA_(273)原毒株及其克隆株的比较研究

本文从形态结构、生物活性、核酸限制性内切酶图谱、结构多肽等方面对中国棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)VHA273多粒包埋型原毒株及其单粒包埋型克隆株H9进行了比较研究.它们对中国棉铃虫三龄初幼虫的LC5o值分别为2.987×104PIBs/mL和1.647×104PIBs/mL当感染剂量为2×107PIBs/mL时,其LT5o值分别是4.866d和4.797d.两个毒株的生物活性差别不大.经SDS-PAGE分析,两毒株结构多肽图谱带型相差较大.两毒株基因组经EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ,Hind Ⅲ和Xba Ⅰ消化后,得到的内切酶图谱表现为两毒株间有差别.这些差异的发现将有助于从分子水平揭示多粒包埋病毒和单粒包埋病毒形成原因.

中国棉铃虫核型多角体病毒VHA273毒株的克隆及基因组物理图谱

利用ＨＺ－ＩＢ３细胞对中国棉铃虫核型多角体病毒（ＨａＮＰＶ）ＶＨＡ２７３毒株进行了三轮空斑纯化，得到一个克隆株Ｈ９。电镜观察表明，此克隆株Ｈ９为单粒包埋核型多角体病毒（ＳＮＰＶ）。Ｈ９的基因组ＤＮＡ经限制性内切酶ＢｇｌＩ，ＨｉｎｄⅢ，ＰｓｔＩ，ＸｈｏＩ，ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＫｐｎＩ，ＢｓｔＥⅡ完全酶切后分别产生１０，１３，７，６，２７，１１，６和１２条片段，以λＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ双酶切片段和ＨｉｇｈＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＤＮＡＭａｒｋｅｒｓ为标准作工作曲线，求出了各限制性内切酶片段的大小。实验测得ＨａＮＰＶ－Ｈ９基因组的大小为１２９．９６ｋｂ，分子量为８５．７７×１０６，表明Ｈ９不同于其它已报道的ＨａＳＮＰＶ。利用单、双酶混合酶切分析和部分酶切分析，通过逻辑推导，完成了Ｈ９基因组ＤＮＡ的ＰｓｔＩ和ＸｈｏＩ各单酶解片段的重叠和延伸，最终构建了Ｈ９基因组ＤＮＡ的ＰｓｔＩ。

中国棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒gp^(37)基因的序列分析

昆虫杆状病毒的 gp37基因与昆虫痘病毒纺锤体蛋白 (fusolin)基因具有较高的同源性。本研究通过末端测序法和引物步移法双向测定了中国棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒 (HaSNPV)gp37基因的核苷酸全序列。HaSNPV的 gp37基因开放阅读框为 84 0个核苷酸 ,共编码 2 79个氨基酸 ,预计蛋白质分子量为 31kDa。在 gp37基因起始密码子上游有一典型的杆状病毒晚期转录启动子结构GTAAG和两个TATAboxes。HaSNPVGP37前 18个氨基酸有很强的疏水性 ,可能是分泌信号肽序列。 16种GP37/Fusolin的氨基酸序列同源性比较分析表明 ,HaSNPVGP37与其它gp37基因的同源性较高 ( 4 0 60 % ) ,与痘病毒的Fusolin的同源性达 30 % 4 0 %左右。这些蛋白有 5个高度保守区 ,预计这 5个保守区为GP37/Fusolin的功能区。

中国棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒多角体蛋白基因的序列分析

以AcMNPV的多角体蛋白基因为探针，定位了中国棉铃虫单粒包理核型多角体病毒（HaSNPV）的多用体蛋白基因。序列测定表明，HaSNPV的多角体蛋白基因编码区为738个核苷酸，编码246个氨基酸，预计蛋白质分子量为29kDa。同源性分析表明，HaSNPV与美洲棉铃虫单粒包理核型多角体病毒（HzSNPV）具有最高的同源性，在整个阅读框架中只有4个碱基的差异，其中第179位碱基的变化导致唯一的氨基酸变化，这种变化并未导致其二级结构的改变。此外，两种病毒该基因的启动子结构也完全一样。HaSNPV与其它的SNPV和MNPV的同源性明显要低。结果预示HaSNPV与HzSNPV可能为同种病毒的不同变种。

中国棉铃虫多粒包埋型核多角体病毒几丁质酶基因的研究

中国棉铃虫多粒包埋型核多角体病毒VHA273毒株的几丁质酶基因的开放阅读框大小为1713bp,编码570个氨基酸残基,分子量约60kDa.氨基酸序列分析显示,杆状病毒与原核生物特别是细菌的几丁质酶具高度同源性,暗示杆状病毒的几丁质酶基因与细菌的几丁质酶基因有更为接近的进化关系,可能源于共同的祖先.

棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析

棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析王根张传溪贡成良金伟吴祥甫（中国科学院上海生物化学研究所，上海２０００３１）关键词棉铃虫，核型多角体病毒，多角体蛋白基因，核苷酸序列，同源性棉铃虫Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉ...

核型多角体病毒对棉铃虫酯酶和酚氧化酶活性的影响

对感染核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis,NPV)的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)幼虫血淋巴进行了酯酶和酚氧化酶电泳分析。结果表明:2种酶带在感染12 h后其活力发生了明显变化;酯酶酶带2 d后发生位移,酚氧化酶酶带5 d发生位移,且各自建立新的酶系统。酚氧化酶比活力分析结果表明:感染NPV后,1 d达到最高点,2～3 d处于最低点,4 d后回升。

PCR法证实棉铃虫核型多角体病毒对棉铃虫经卵和蛹的垂直传播

根据棉铃虫核型多角体病毒的多角体蛋白基因设计 5’引物和 3’引物 ,通过PCR技术成功扩增 389bp的目的片段 ,并对该片段进行了克隆和测序。结果表明 ,扩增片段为棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因序列。该检测方法的灵敏度为 1 0fg,应用此技术从带毒的虫卵和蛹的总DNA中也检测到该病毒的存在。

棉铃虫核型多角体病毒与化学杀虫剂和卵磷脂混用的增效作用

棉铃虫核型多角体病毒 (HaNPV)分别与三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、灭净菊酯、灭多威、辛硫磷、甲基对硫磷和乙酰甲胺磷等化学杀虫剂混合饲喂棉铃虫幼虫 ,统计致死中浓度LC50 ,计算增效比 ,测定虫体内与抗性有关的三种重要酶 :多功能氧化酶 (MFO)、羧酸酯酶 (CarE)、乙酰胆碱酯酶 (AChE)的活性。研究大豆卵磷脂对HaNPV致病性的影响。结果表明 :HaNPV与化学杀虫剂混合饲喂抗性棉铃虫 ,生测统计增效比均大于 1 0 ,特别是病毒与甲基对硫磷混用 ,增效比更是达到 3 53,表现出良好的增效作用。混剂感染抗性棉铃虫 ,虫体内MFO的活性比化学杀虫剂单用时降低 3～ 12倍 ,CarE和AChE的活性也比化学杀虫剂单用时低 ,HaNPV明显抑制了化学杀虫剂对MFO和CarE的诱导作用。HaNPV与大豆卵磷脂混用 ,提高了HaNPV对棉铃虫的感染致死率 ,缩短了致死中时间 (LT50 )。

棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶的原核表达及其协同增效作用

【目的】在大肠杆菌中表达棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(HearNPV)几丁质酶(Chi A),利用表达产物进行病毒增效作用研究,以明确杆状病毒Chi A对HearNPV的协同增效作用。【方法】用PCR方法扩增出不含N端信号肽编码序列的Chi A基因片段,分别克隆至原核表达载体pMAL-p2x和pET-32a中,构建重组表达载体,并分别在大肠杆菌TB1和BL21(DE3)中进行融合表达,测定融合蛋白对HearNPV的增效作用。【结果】克隆的基因片段经过测序后连接表达载体,成功构建了重组表达载体pMAL-p2x-Chi A和pET-32a-Chi A。重组载体转化相应菌株并进行诱导表达,发现pMAL-p2x-Chi A在大肠杆菌TB1中的表达量占细菌总蛋白的15.8%,其中20.0%为可溶性表达;pET-32a-Chi A在BL21(DE3)中的表达量占细菌总蛋白的26.8%,其中30.2%为可溶性表达。选用pET-32a-Chi A在BL21(DE3)中的表达产物作为增效蛋白,当表达的可溶性HearNPV Chi A的添加水平为1.0μg/mL时,其能够显著提高病毒毒力,棉铃虫的死亡率较对照提高36.6%。【结论】利用大肠杆菌表达的可溶性HearNPV Chi A,对HearNPV具有明显的增效作用。

科云牌棉铃虫核型多角体病毒生物农药的规模化生产和应用

昆虫病毒生物农药是纯天然无公害生物农药产品,本文介绍了中国科学院动物研究所同河南省济源白云实业有限公司合作,成功开发并商业化棉铃虫病毒生物农药的基本情况。我们开发的棉铃虫病毒生物农药注册商标"科云牌",包括两个产品:科云牌5 000亿PIB/g棉铃虫病毒原粉和科云牌600亿PIB/g棉铃虫病毒水分散粒剂。原粉产品已出口到欧洲,制剂产品用于棉铃虫防治,2006至2007年在棉田累计推广应用10万hm^2次。

棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白聚集体特性及与其它包涵体蛋白的血清学关系

纯化的多角体碱解释放多角体蛋白 ,经等电点沉淀和柱层析对多角体蛋白进行分离纯化 ,结合SDS PAGE、免疫双向扩散、免疫电镜等方法 ,证明棉铃虫核型多角体病毒 (HaNPV)的多角体蛋白以聚集体形式存在。用ELISA法检测包涵体蛋白之间的血清学关系 ,结果表明 ,与黄地老虎颗粒体病毒 (AsGV)和粘虫颗粒体病毒 (PsGV)颗粒体蛋白相比较 ,HaN PV多角体蛋白与葡萄天蛾核型多角体病毒 (ArNPV)和黄地老虎核型多角体病毒 (AsNPV)

棉铃虫核多角体病毒细胞凋亡抑制基因iap3的序列分析

杆状病毒的细胞凋亡抑制蛋白在提高病毒的感染力和决定病毒的宿主域中起作用 ,具有应用于基因工程改良病毒杀虫剂杀虫特性的潜力。本研究应用末端测序法和引物步移法双向测定了中国棉铃虫核多角体病毒的iap3基因。HaSNPViap3基因的开放阅读框大小为 80 7bp ,在起始密码子上游 - 83～ - 79的位置处发现有一个晚期同源转录结构GTAAG ,在翻译终止密码子下游的 2 1～ 2 6碱基处发现有一典型的 poly (A)信号。HaSNPVIAP3蛋白的N端发现有一个典型的BIR结构和一个类BIR结构 ,C端有一个典型的RING锌指结构。对 17种IAP的排列显示 ,IAP类蛋白具有较保守的BIR结构和RING锌指结构 ,推测BIR结构内的保守氨基酸可能对其抗细胞凋亡起决定作用。

棉铃虫（Heliothisspp）核型多角体病毒四个分离株的比较研究

本文从形态结构、生物活性、结构多肽、核酸限制性内切酶图谱和核酸同源性等方面对棉铃虫核型多角体病毒四个分离株（两个ＳＮＰＶ分离株：ＨａＳ、ＨｚＳ，和两个ＭＮＰＶ分离株：ＨａＭ１、ＨａＭ２）进行了比较研究。它们对中国棉铃虫二龄末三龄初幼虫的ＬＤ５０佰依次为３６１、３８７、２６３３、３５６０ＰＩＢｓ／克饲料，当感染剂过为５×ｌ０３ＰＩＢｓ／克饲料时，其ＬＴ５０值依次为４．６、４．９、６．４和６．６天。两个ＳＮＰＶ分离株的生物活性显著高于两个ＭＮＰＶ分离株。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，四个分离株多角体蛋白均为一条带，两个ＭＮＰＶ分离株结构多肽均具有相同的迁移率，两个ＳＮＰＶ分离株的结构多肽图谱也颇相似，但ＳＮＰＶ与ＭＮＰＶ分离株之间带型相差较大。各分离株基出组经ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａＩ消化后，得到的内切酶图谱表现为两个ＮＭＰＶ分离株一致，两个ＳＮＰＶ分离株也很相似，而ＳＮＰＶ与ＭＮＰＶ分离株之间相差很大。严格条件杂交结果表明：两个ＳＮＰＶ分离株的基因组有较高的同源性，而ＳＮＰＶ与ＭＮＰＶ基因组之间的同源性极低。

中国棉铃虫核多角体病毒VHA273毒株DNA的特性

VHA273毒株纯多角体经碱解、酶解及饱和酚一步法和二步法抽提的基因组,具有典型的DNA吸收光谱。吲哚法亦确证为DNA,无RNA。超离心沉降分析,扫描出主峰沉降常数为26S,次峰9.7S。热变性温度法测得Tm=89.6℃,计算(G+C)％=49.53。电镜观察DNA呈3种典型形态。大的闭环DNA平均长度29.8μ,计算得分子量是61.7×10~6;有少量极小闭环DNA存在。0.7％琼脂糖凝胶电泳显示,DNA主带清晰浓重,发现还有5条微弱次带,约2.5～3.7kb。该DNA用4种限制性核酸内切酶Bg1 Ⅱ、BamHⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ分别酶切成11、8、14和13条带。用片段积加法求出的分子量彼此很接近,平均为67.0×10~6道尔顿。酶切图谱显示,5条弱带对4种内切酶概不敏感。

棉铃虫核型多角体病毒在生态环境中的滞留及作用

棉铃虫核型多角体病毒（ＨａＮＰＶ）杀虫剂可湿性粉剂防治第三代棉铃虫，防治效果为８６．２％。使用酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）检测棉铃虫核型多角体病毒在土壤中的滞留，结果表明：施用病毒杀虫剂１、３、５、７天和两个月后都可检测到该病毒的存在。１９９３年９月上旬从河南封丘棉田采集的露水，ｐＨ为７．９８，病毒多角体在露水中保存３天，其生物活性无明显下降。

棉铃虫核型多角体病毒防治棉铃虫的研究

棉铃虫核型多角体病毒（ＮＰＶ）是一种新型生物农药，对棉铃虫和烟青虫均有较高的致病力。一般防治效果为７２％～７５％，高者达８０％以上，对天敌昆虫无杀伤力，对人畜安全无毒。