侵染番茄的中国番木瓜曲叶病毒基因组结构特征

从云南元谋采集表现曲叶症状的番茄样品中分离粉虱传双生病毒(Whitefly-transmitted geminivirus,WTGs)分离物YN678。序列分析表明其DNA-A为单链环状,全序列长度为2739 bp,编码6个ORFs。BLAST比对发现,该分离物与双生病毒科菜豆金色黄花叶病毒属的中国番木瓜曲叶病毒HeNZM1分离物(PaLCuCNV-[HeNZM1])最为接近,相似性为98.5%,表明番茄中的分离物YN678是PaLCuCNV的1个分离物。利用WTGs卫星分子DNAβ特异引物Beta01/Beta02进行PCR扩增、克隆和测序,在YN678中扩增到DNAβ分子,全长为1357 bp,该序列与中国番茄黄曲叶病毒YN149分离物(TYLCCNV-[YN149])伴随的DNAβ相似性最高,达到99.1%。这是首次从云南番茄中分离到中国番木瓜曲叶病毒。

侵染稀硷的中国番茄黄化曲叶病毒及其卫星DNA全基因组结构特征

从云南红河稀硷上分离到病毒分离物Y6 4 ,全序列测定表明 ,Y6 4DNA_A全长 2 730个核苷酸。基因组比较发现 ,Y6 4DNA_A与中国番茄黄化曲叶病毒Y38分离物 (TYLCCNV_[Y38])同源性最高 (99% ) ,与中国番茄黄化曲叶病毒广西分离物 (TYLCCNV)的同源性次之 (96 % ) ,而与亚洲地区的其它双生病毒的同源性均在 83%以下 ,表明稀硷上的分离物Y6 4是TYLCCNV的 1个分离物。利用DNAβ的特异性引物beta0 1和beta0 2 ,在病毒分离物Y6 4中扩增到卫星DNA分子 (Y6 4 β)。序列分析表明 ,Y6 4 β全长 1 340个核苷酸 ,至少在其互补链上编码 1个有功能的ORF(C1 )。Y6 4 β的全序列与TYLCCNV的各个分离物的卫星分子 (Y38β、Y36 β和Y8β)的同源性最高 ,分别为 99 5 %、99 5 %和 99 3% ;与其它已报道的卫星DNAβ的同源性均低于 6 6 4 %。系统关系树研究表明 ,卫星DNAβ分子与其辅助病毒是共同进化的。

刺茄中分离的中国番茄黄化曲叶病毒及伴随的卫星DNA分子的全基因组结构

从云南砚山刺茄(Solanum aculeatissimum)上分离到病毒分离物Y322,全序列测定表明,Y322DNA-A全长2730个核苷酸,共编码6个ORF。基因组比较发现,Y322DNA-A与中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)各分离物的同源性最高(88.3%～99.2%),而与其它双生病毒的同源性均在79.6%以下,表明Y322是TYLCCNV的一个分离物。利用DNAβ的特异性引物在Y322中扩增到DNAβ分子(Y322β),序列分析表明,其全长1331个核苷酸,与TYLCCNV伴随的DNAβ的同源性最高,达75.1%～93.1%,而与已报道的其它种类的DNAβ的同源性均低于55.4%。这是首次在刺茄中检测到中国番茄黄化曲叶病毒。

侵染广西烟草的中国番茄黄化曲叶病毒及其伴随的卫星DNA分子的基因组特征

从中国广西靖西的烟草病株上分离到病毒分离物G102和G103,用双生病毒特异性引物均扩增出约500bp的片段,两者序列同源性达99%。对G102基因组DNA-A全序列测定表明,其全长为2728个核苷酸,与中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)同源性最高,达96.5%。进一步研究发现,G102和G103都伴随有长为1342个核苷酸的卫星DNA分子(DNAβ),这两个DNAβ分子的全序列与TYLCCNV的DNAβ同源性最高,分别为92.9%和93.4%。这是首次明确广西分离的TYLCCNV也伴随有卫星分子。

内生细菌EBS05对番茄抗中国番茄黄化曲叶病毒的诱导作用

为明确内生细菌EBS05对番茄抗中国番茄黄化曲叶病毒（ TYLCCV）的诱导作用,以番茄品种江蔬14为材料,测定了生防细菌诱导处理后番茄体内防御相关酶活性的变化,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测了其同工酶的变化。研究结果显示：内生细菌EBS05对番茄植物具有明显的促生作用；内生细菌EBS05诱导处理再接种 TYL-CCV后,番茄黄化曲叶病毒病病害明显减轻,诱导抗病性效果达53.60%,且发生时间延迟。菌株EBS05诱导后7-15 d,番茄叶片超氧化物歧化酶（ SOD）、过氧化物酶（ POD）、多酚氧化酶（ PPO）和苯丙氨酸解氨酶（ PAL）活性均显著高于健康植株（对照）；此外,TYLCCV侵染后9-15 d,番茄体内POD和PPO活性显著低于对照,相应的同工酶积累量也减弱,而内生细菌EBS05可诱导番茄体内SOD、POD和PPO同工酶的积累量增加,并产生新的同工酶带。

中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCV-CHI)外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

经PCR获得了中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCV-CHI)外壳蛋白(CP)基因,并克隆到pGEM-7Zf(+)载体上.序列分析表明,TYLCV-CHI感染番茄或烟草时,CP基因的核苷酸序列发生变化,并且在烟草上随感染时间的延长,突变频率增高.连接到含有编码tRNAarg4基因argU的表达载体pSBET后,TYLCV-CHI CP基因在大肠杆菌中以包含体形式得到大量表达(约33 ku).以表达的蛋白作抗原免疫家兔,制备了抗TYLCV-CHI CP的抗血清.ELISA实验表明,该血清与抗原特异反应,血清效价为1:3000.Western印迹实验还表明,该血清除了与感染TYLCV-CHI的番茄、烟草有特异免疫反应外,还与感染南瓜曲叶病、烟草曲叶病的叶片有免疫反应,表明这些病毒之间有明显的血清学关系.

伴随中国番茄黄化曲叶病毒的卫星DNAβ在本氏烟中的种群变异

采用根癌土壤杆菌介导接种和分子克隆技术,分析中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellowleaf curl China virus,TYLCCNV)Y10分离物(Y10)的伴随卫星DNAβ(Y10β)在本氏烟中的种群变异.结果显示表明:本氏烟中Y10β种群所有克隆均发生不同程度的变异,在接种60 d及120 d后其种群突变频率分别为2.48×10-3和2.54×10-3,表明该卫星DNAβ在同一寄主体内的侵染时间对其种群变异水平没有明显影响;Y10β种群的碱基突变位点主要分布于DNAβ的富A(A-rich)区,在卫星共同区(SCR)内碱基突变位点最少;其碱基突变类型以A→G,G→A,T→C突变及碱基G缺失等突变类型的比例较高,并且在A-rich区内出现多个克隆在同一核苷酸位点发生相同突变的现象.

抗黄花曲叶病毒病番茄品种试验

以番茄5个品种为供试材料,研究其抗黄花曲叶病毒能力。结果表明,东风四号表现长势均匀健壮,坐果数最多,产量最高,可作为早秋番茄进行大力推广。好盈220表现长势旺且粗壮,坐果较好,上市早,产量高,商品性好,可作为秋冬番茄进行推广。

中国番茄黄化曲叶病毒编码的RNA沉默抑制子AC4蛋白的核酸结合特性

农杆菌共浸润试验结果表明:中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)Y10分离物编码AC4蛋白是RNA沉默抑制子。为了研究RNA沉默抑制子AC4蛋白的作用机制,将TYLCCNV-Y10的AC4基因插入到原核表达载体pET-32a的多克隆位点上,构建重组原核表达载体pET32a-Y10AC4。将重组载体导入BL21(DE3)pLysS进行AC4蛋白表达,并在自然条件下纯化蛋白。利用原核表达的AC4蛋白进行电泳迁移率变动试验(electrophoretic mobilityshift assay,EMSA),分析AC4蛋白分别与单、双链siRNA和单、双链长RNA的结合情况。试验结果表明:TYLCCNV-Y10编码的AC4蛋白具有结合单链siRNA和单链长RNA特性,而不与双链siRNA和双链长RNA结合。

中国番茄黄化曲叶病毒双向启动子的鉴定

以中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)Y10分离物感染的烟草植物总DNA为模板,扩增病毒双向启动子片段,并分别以不同方向与gus基因和nos终止子融合,构建了植物表达载体.用土壤杆菌介导的方法将质粒载体导入本氏烟叶片细胞和植株茎部进行瞬时表达结果表明,互补链和病毒链启动子均能驱动gus基因表达,并且互补链启动子的活性高于病毒链启动子的活性. TYLCCNV伴随的卫星DNAβ分子的βC1的表达载体与启动子载体进行瞬时共表达时,βC1对病毒链和互补链启动子的活性均没有调节作用.

与中国番茄黄化曲叶病毒伴随的DNAβ分子βC1缺失突变体介导的交叉保护作用初步研究

与中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)Y10分离物(Y10)伴随的卫星DNAβ(Y10β)分子的βC1基因缺失突变体(Y10ΔC1β)能介导对同源或异源DNAβ的交叉保护作用.所有预先接种Y10+Y10ΔC1β的本氏烟及心叶烟在挑战接种Y10+Y10β后表现的症状均比未经免疫的植株症状轻,在本氏烟上的保护效果较心叶烟强,且Y10ΔC1β介导对同源DNAβ的保护效果明显好于对烟草曲茎病毒(TbCSV)伴随的DNAβ的保护.

从烟草上分离的中国番茄曲叶病毒及其卫星DNA全基因组结构特征

本研究从具有典型曲叶病症状的广西靖西烟草病植株上分离到病毒分离物JX-2,全基因组序列测定结果表明,JX-2DNA-A全长2738个核苷酸,共编码6个开放阅读框架(open reading frames,ORFs),其中病毒链编码AV1(CP)和AV2两个ORFs,互补链编码AC1、AC2、AC3和AC4共4个ORFs。BLAST结果表明,JX-2DNA-A与中国番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl China virus,ToLCCNV)各分离物的相似性在93.0%～99.7%之间,其中与ToLCCNV广西番茄分离物ToLCCNV-G32的相似性最高,达99.7%,而与其它双生病毒的同源性均在88.0%以下,表明JX-2是ToLCCNV的一个分离物。基于JX-2和已报道的双生病毒属代表种DNA-A全基因组核苷酸序列构建的系统进化树显示,JX-2与ToLCCNV-G32分离物的亲缘关系最近,并与ToLCCNV其它分离物形成一个分支,而与其它10种双生病毒的亲缘关系均相对较远。利用双生病毒卫星DNAβ的特异性引物β01/β02在JX-2样品中扩增到DNAβ分子(JX-2β),全长为1341个核苷酸,其互补链编码1个ORF(即βC1),并包含一个富含A序列和一个卫星病毒保守序列。序列分析表明,JX-2β与ToLCCNV伴随的DNAβ的相似性在91.0%～96.1%之间,其中与ToLCCNV-G61DNAβ和ToLCCNV-G18DNAβ的相似性最高(96.1%),与其它卫星DNAβ的相似性均低于61.8%。基于JX-2β全基因组核苷酸序列构建的系统进化关系树显示,JX-2β与ToLCCNV G61分离物伴随的DNAβ亲缘关系最近,并形成一个独立的分支,再与ToLCCNV其余两个分离物伴随的DNAβ形成一个较大的分支。这是首次报道从烟草中分离到的中国番茄曲叶病毒及其伴随卫星DNA分子的全基因组结构特征。

番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因dsRNA载体的构建及其表达

将中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)外壳蛋白基因(coat protein,CP)同源的部分片段双链RNA重组至植物表达载体pBIN19,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404导入本氏烟(Nicotianabenthamiana)。PCR筛选表明,目的片段已整合至转基因植株的基因组DNA中,引起与其同源的基因发生沉默,从而可抑制病毒复制,达到抗该病毒的目的,为防治这类病毒病害提供了新的可能。

侵染广西辣椒的两种单组分菜豆金色花叶病毒属病毒的分子特征

【目的】明确引起广西百色市辣椒呈现叶片上卷、皱缩等症状的病毒病原,并对各病毒分离物的遗传进化关系进行分析,旨在为辣椒病毒病的防控提供科学依据。【方法】从广西百色市采集4份疑似被菜豆金色花叶病毒属病毒感染的辣椒样品,利用PCR、分段克隆、核苷酸序列比对分析、进化树构建等方法对疑似样品进行鉴定及遗传进化分析。【结果】PCR结果显示,4个样品中均能扩增出约570 bp目标PCR条带,将PCR产物直接送样测序,所得序列进行blastn分析发现,4条序列分别与已登录GenBank的TYLCV和PaLCuCNV各分离物的序列具有较高的核苷酸相似性,证实所采集的辣椒植株受到菜豆金色花叶病毒属病毒侵染。参考已登录GenBank的TYLCV(GenBank登录号:MG904859和KY783940)、PaLCuCNV(GenBank登录号:KU892661和MW779523)的序列设计2对背靠背引物,随机选择2份阳性样品进行全基因组扩增和序列测定,将所得PCR产物纯化后克隆至pMD18T载体上,挑选阳性克隆进行测序,从2份阳性样品中共获得3条病毒全长基因组序列,将所得序列在GenBank中进行blastn分析,发现其中2条序列与已登录GenBank的部分TYLCV分离物的核苷酸相似性达到91%以上,1条序列与已登录GenBank的部分PaLCuCNV分离物核苷酸相似性在91%以上。根据双生病毒的分类标准,确定侵染广西辣椒的双生病毒为TYLCV和PaLCuCNV的不同分离物。进化树分析发现,TYLCV广西辣椒分离物BS66-1与TYLCVSG1分离物(GenBank登录号:MT969010,寄主为番茄)具有较近的亲缘关系,而TYLCV广西辣椒分离物BS67-1则与TYLCV GX和TYLCV BS3分离物(GenBank登录号:MW389934、MT375610,寄主均为番茄)具有较近的亲缘关系;PaLCuCNV广西辣椒分离物BS66-2则与PaLCuCNV GX01分离物(GenBank登录号:MW779523,寄主为番茄)具有较近的亲缘关系。【结论】侵染广西辣椒呈现叶片上卷、皱缩等症状的病原为TYLCV和PaLCuCNV,本研究为菜豆金色花叶病毒属病毒侵染广西辣椒的首次报道。

白银市番茄黄化曲叶病毒的鉴定

根据前人研究,对白银市疑似番茄黄化曲叶病毒病样品合成相同序列引物,利用RCR扩增技术,并将测序结果在NCBI上进行BLAST。结果表明,该片段为番茄黄化曲叶病毒的一段序列,证实白银地区番茄感染了TYLCV。

中国农业科学院揭示双生病毒抑制细胞自噬的新机制

中国农业科学院植物保护研究所周雪平课题组揭示了双生病毒侵染后植物细胞自噬被激活,抑制病毒侵染,双生病毒编码的毒力因子C2可以通过抑制烟草和番茄的ATG7和ATG8的互作并降解ATG7和ATG8蛋白的表达从而抑制细胞自噬活性,揭示了病毒感染的新机制。研究表明,云南番茄曲叶病毒、番茄黄化曲叶病毒、印度绿豆黄化花叶病毒等多种双生病毒能够激活细胞自噬途径,上调相关基因m RNA的表达。

日光温室番茄抗黄化曲叶病毒品种筛选试验

2015年秋冬茬番茄黄化曲叶病毒病在贺兰县新平园区、雄英园区开始大面积发生,部分抗病毒品种也不同程度发病,并与蕨叶型、花叶型病毒复合发病,给设施番茄生产带来较大损失与威胁,2茬秋冬茬番茄发病率超过60%,损失超过30%。为了解决该病害的发生和流行蔓延,在新平园区选择具有代表性的二代日光温室1栋,引进美粉869、美粉863、博瑞1号、博瑞39号、诺奇8号、诺奇9号共6个,对抗黄化曲叶病毒病番茄品种的抗病性、丰产性、商品性进行对比筛选试验,结果显示博瑞39号、诺奇9号这2个品种,果穗节位低,花穗数多,果形好,产量较高,且没有发生病虫害,建议大面积应用;美粉869、美粉863产量适中,生长势良好,性状稳定,适宜日光温室推广应用。

四川番茄黄化曲叶病病原分子鉴定及变异分析

【目的】明确引起四川番茄黄化曲叶病(Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)的病原。【方法】对采自四川攀枝花市田间表现矮化、黄化和曲叶症状的番茄植株SC64-67,通过PCR、克隆及测序等技术获得病毒及卫星DNA的全基因组序列,并对序列进行变异分析。【结果】利用双生病毒简并引物PA/PB从4个样品中均扩增得到约500 bp的片段,随机选择SC65进行DNA-A全基因组扩增和序列测定,该DNA分子全长为2 732 nts,系统进化分析表明,其与已报道的中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)来自云南元谋的菜豆分离物(TYLCCNV-Bean-YM)的核苷酸序列相似性最高,为96.0%。检测发现,所有分离物均伴随有卫星DNAβ分子。全序列测定表明SC65 DNAβ全长1 338 nts,与分离自云南楚雄番茄上的TYLCCNV-Y25伴随的卫星DNAβ亲缘关系最近,核苷酸序列相似性为77.5%。【结论】研究表明四川番茄黄化曲叶病样品均受到TYLCCNV/DNAβ病害复合体的侵染,但其病毒DNA-A和卫星DNAβ分子来源于TYLCCNV的不同分离物。

安徽淮北番茄曲叶病的病原鉴定初报

采用分子手段鉴定了安徽淮北番茄曲叶病的病原。从安徽淮北番茄温室采集番茄叶片样本,用CTAB法从番茄叶片中提取总DNA。利用简并引物PA、PB进行PCR扩增,从大部分样本中扩增出双生病毒500 bp特异性条带。将扩增片段克隆并测序,该片段序列全长541 bp,与我国报道的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）各个分离物序列相似性均很高,达到95.9%~99.4%,可以初步明确侵染安徽淮北番茄的双生病毒为番茄黄化曲叶病毒（TYL-CV）。安徽淮北TYLCV 500 bp片段序列与山东TYLCV相似性最高,达99.4%,而且从构建的系统关系树也可以看出,安徽淮北TYLCV与山东TYLCV的亲缘关系最近,推测安徽淮北番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）可能来源于山东。

重防番茄TY病毒病

据各地菜农反馈的信息,山东各地栽培的番茄上相继发生了一种从未见过的病毒病,目前,已造成山东莘县近百个大棚减产或绝产。同时,临淄、广饶、青州等地及寿光市内番茄主要种植基地古城街道一带也出现相同症状的番茄病毒病。为此,记者从寿光市内及周边不同地点分别采集了病症表现较典型的样本，经有关专家确认是双生病毒中的中国番茄黄化曲叶病毒，即番茄TY病毒病。