中国红豆杉种子超低温保存技术研究

【目的】探索中国红豆杉种质资源的超低温保存技术,为红豆杉种质资源的开发利用提供支持。【方法】采用多重单因素试验法,将中国红豆杉种子前处理后,采用9种不同的冷冻保护剂处理,之后分别进行0℃冷浴静置、25℃室温0.6MPa抽真空和冰浴250W超声波处理,处理时间分别为0,5,10和15min;然后按照4种不同的冷冻方式投入液氮中冷冻保存,保存结束后分别采用37℃水浴快速、20℃流动自来水、5℃慢速和25℃室温静置进行解冻,最后探讨了在较优的3种冷冻保护剂条件下保存时间对红豆杉种子活力的影响。以氯化三苯基四氮唑(TTC)还原法测定冷冻保存后种子的活力。【结果】冷冻保护剂、保护剂处理方式和处理时间、冷冻方式、解冻方式、保存时间均对超低温冷冻保存后的红豆杉种子活力具有明显影响。9种冷冻保护剂中较优的是体积分数8%二甲基亚砜(DMSO)、体积分数5%乙二醇和PVS4,冻存后中国红豆杉种子TTC还原量分别为(2.679 7±0.255 6)、(2.290 4±0.040 7)和(2.055 5±0.009 9)mg/g;冰浴250 W超声波处理10 min的效果最好,TTC还原量为(2.143 1±0.098 6)mg/g;4种冷冻方式中-20℃预冻1h后投入液氮保存红豆杉细胞活性相对较高,TTC还原量为(2.454 4±0.069 5)mg/g。37℃水浴快速解冻后细胞活力更高,TTC还原量为(2.469 7±0.022 1)mg/g。【结论】红豆杉种子的最佳超低温保存技术条件为:采收后的新鲜种子干燥后于5℃条件下放置9个月打破其休眠,然后机械去掉种子硬壳,用蒸馏水浸泡12h,脱去种子内皮,在无菌条件下用体积分数75%酒精消毒30s,无菌水冲洗2～3次,沥干,移入冷冻管中,加入体积分数8%DMSO冷冻保护剂,封口,于冰浴250 W超声波条件下浸泡处理10min,于-20℃预冻1h后置于液氮中冷冻保存72h,然后在37℃水浴中快速解冻。在此条件下,中国红豆杉种子活力最高,TTC还原量可达(2.469 7±0.022 1)mg/g,而且同等条件下,选用PVS4冷冻保护剂更有利于红豆杉种子的超低温长期(1个月以上)保存。