中国野生刺葡萄抗白腐病NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

【目的】通过同源克隆法从刺葡萄‘高山2号’叶片中得到抗白腐病基因的同源片段,为筛选葡萄抗白腐病基因奠定基础。【方法】根据已知植物抗病基因NBS-LRR保守区设计简并引物,从高抗葡萄白腐病刺葡萄‘高山2号’的基因组DNA与cDNA上得到抗病基因同源片段(RGAs),并对其表达分析进行检测。【结果】从刺葡萄‘高山2号’上获得了10个NBS-LRR类抗病基因同源片段,10条葡萄RGAs间在氨基酸水平上的同源性表现出丰富的多态性,进一步分析发现,在10条葡萄RGAs中,4个推测所属基因为non-TIR-NBS-LRR类抗病基因,6个所属基因为TIR-NBS-LRR类抗病基因。定量PCR分析表明,NB7基因受到白腐菌的诱导,而且NB7基因在刺葡萄叶片中为低丰度表达,NBS6基因受到白腐菌的诱导后为下调表达。【结论】在刺葡萄上成功获得了抗病基因同源序列,通过荧光定量PCR分析发现,NB7基因与NBS6基因都受到白腐菌的诱导表达,为最终克隆得到葡萄抗白腐病基因奠定基础。

刺葡萄0943抗白腐病转录因子VdWRKY49的克隆及序列分析

【目的】获得来源于中国野生抗病种质刺葡萄0943的转录因子Vd WRKY49基因,揭示其序列特征、基因功能与抗葡萄白腐病之间的关系,初步揭示抗病种质抗病机制。【方法】利用同源克隆的方法分别获得刺葡萄0943的转录因子Vd WRKY49基因的编码区和启动子区域,分析其序列特征,通过实时荧光定量检测其对白腐病菌和水杨酸诱导的反应,同时以感病品种欧亚种‘黑比诺’为对照,分析不同种质中的转录因子Vd WRKY49基因序列及表达差异。【结果】来源于中国野生种质刺葡萄0943的Vd WRKY49基因,在其编码区和启动子区域都有抗病基因的序列特征和位点特征,同时也存在不同,在DNA和氨基酸水平上与来源于欧亚种的‘黑比诺’Vv WRKY49有差异,这些差异可能造成了其结构功能的差异;受到葡萄白腐病和水杨酸诱导后,Vd WRKY49基因的表达量明显高于Vv WRKY49。【结论】来源于刺葡萄0943的Vd WRKY49基因受到白腐病菌和水杨酸诱导后表达量和表达模式明显区别来源于‘黑比诺’的Vv WRKY49基因,推测在葡萄抗病途径中转录因子WRKY49具有重要的生物学作用。

刺葡萄抗白腐病转录因子VdWRKY53基因克隆及表达

利用同源克隆的方法,分别获得‘刺葡萄0943’的转录因子VdWRKY53基因的编码区和启动子区域,分析其序列特征,通过实时荧光定量检测其对白腐病菌侵染和水杨酸诱导的反应,并以感病品种欧亚种‘黑比诺’为对照,分析不同种质中转录因子VdWRKY53基因序列及表达差异。结果表明:‘刺葡萄0943’的VdWRKY53基因,在其编码区和启动子区域都有抗病基因的序列和位点特征,在DNA和氨基酸水平上与‘黑比诺’VvWRKY53有5处差异,这5处氨基酸差异可能造成了其功能的差异;‘刺葡萄0943’和‘黑比诺’中的WRKY53基因启动子受葡萄白腐病菌和水杨酸诱导后表达量增加,且VdWRKY53基因表达量和趋势不同于‘黑比诺’VvWRKY53。生物信息学分析和实时荧光定量表明,在‘刺葡萄0943’抗病途径中VdWRKY53转录因子具有重要的生物学作用。

Mlo基因在葡萄抗白腐病中作用的研究

Mlo转录因子是植物抗病反应中一类重要的负调控因子。试验通过对葡萄(Vitis vinifera)VvMlo基因家族成员的基本特征、基因结构、染色体位置、蛋白结构进行分析,结合其他作物已报道的抗病相关Mlo基因构建系统进化树,推断与葡萄抗病机制相关的Mlo基因。另以抗病刺葡萄(V.davidii)品种‘刺葡萄0943’和感病葡萄(V.vinifera)品种‘美人指’为材料,分析不同材料Mlo基因的表达量,获得对白腐菌黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)有响应的Mlo基因。结果显示:抗白粉病的拟南芥Mlo基因(AtMlo2、AtMlo6、AtMlo12)、番茄(Solanum lycopersicum)SlMlo1基因以及葡萄Mlo基因(VvMlo3、VvMlo6、VvMlo9.1、VvMlo13.1、VvMlo13.2、VvMlo17)聚在第IV组。第IV组中的‘刺葡萄0943’和‘美人指’Mlo基因在接种白腐菌后有不同的响应。此外,在白腐菌侵染过程中,第VI组中VvMlo15的表达量明显高于VdMlo15,且在整个接菌过程中VvMlo15对白腐菌侵染有响应,VdMlo15对白腐菌几乎无响应。VvMlo15的基因结构、蛋白结构、分子质量、等电点、跨膜结构等特点也与第IV组中的VvMlo基因特点更相似。综合推测,VdMlo15在葡萄抗白腐病方面可能具有重要作用。