N-乙酰半胱氨酸对CD4^+中央记忆性T细胞体外扩增的影响

【目的】探讨小分子药物(N-乙酰半胱氨酸,NAC)对CD4+中央记忆性T细胞(TCM)体外扩增的影响从而改善过继免疫治疗的效果。【方法】体外分离人类的外周血CD4+T淋巴细胞,将细胞分为两组(实验组和对照组)进行细胞培养,实验组加入N-乙酰半胱氨酸后,通过流式细胞仪和细胞计数仪对两组细胞中的CD4+TCM的扩增情况进行检测。【结果】在CD4+T细胞体外扩增实验中,10 mmol/L的NAC为促进细胞扩增的最佳浓度;NAC对TCM在CD4+T细胞中的比例无明显的影响;在CD4+T细胞扩增的第15天检测其中TCM的细胞数量,对照组中TCM的数量为(7.24±0.54)×105,实验组中TCM的数量为(5.13±0.47)×106,较之对照组,其TCM的数量有着7倍左右的扩增;对上述两组数据进行统计学分析(t检验),P<0.01,表明差异具有统计学意义;对上述两组细胞进行凋亡检测,发现实验组中凋亡细胞的比例低于对照组。【结论】NAC可有效地促进CD4+TCM细胞的扩增,为过继免疫治疗提供简单、安全及有效的体外扩增方法 。

糖皮质激素对体外中央记忆性CD8^+ T淋巴细胞的诱导分化作用

目的:以糖皮质激素对人CD8^+ T淋巴细胞的诱导作用为线索,探究其对体外CD8^+ 中央记忆性T淋巴细胞(central memory T cells,T_(CM))的诱导分化作用,以期为CD8^+ T_(CM)过继性免疫疗法提供新的扩增方案。方法:通过密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞,经磁珠和流式细胞术分选出初始CD8^+ T细胞,将细胞使用细胞因子激活之后分为对照组和实验组,在实验组中加入不同浓度的2种糖皮质激素(醋酸可的松和氢化可的松),进行体外培养,最后通过流式细胞术检测2组细胞中CD8^+ T_(CM)的诱导分化情况,并通过CFSE染色判断细胞增殖情况,通过早期凋亡试剂Annexin V染色判断药物本身对CD8^+ T细胞的毒性作用。结果:浓度梯度实验发现,1μmol/L醋酸可的松对CD8^+ T_(CM)表现出良好的诱导效果,氢化可的松在0.5μmol/L的诱导效果较好。分别在体外培养的第3天和第6天,CFSE染色法检测细胞的增殖情况,经统计学分析发现实验组和对照组之间的差异无统计学显著性,表明糖皮质激素不影响细胞的自然增殖。Annexin V染色法表明,这2种药物无显著的促进凋亡作用,对淋巴细胞毒性小。结论:糖皮质激素在体外对人CD8^+ T_(CM)具有良好的诱导作用。这为改善过继免疫治疗中T_(CM)的体外扩增提供新的参考方法,并且在理论上加深对糖皮质激素生物学功能的理解。

IL-7/IL-15/IL-21/IL-23体外联合刺激有效促进人CD8+中央记忆性T细胞生成

目的比较不同细胞因子组合联合抗CD3/CD28磁珠体外诱导CD8^(+)中央记忆性T细胞(Tcm)体生成的作用,为CD8^(+)Tcm过继性免疫疗法的临床应用提供实验依据。方法分离健康供者外周血单个核细胞(PBMC),应用免疫磁珠法分离纯化初始CD8^(+)T细胞,CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激48 h,同时根据细胞因子种类和组合进行分组:白细胞介素2(IL-2)、IL-7/IL-15、IL-7/IL-15/IL-21、IL-7/IL-15/IL-21/IL-23。采用全自动血球计数仪进行细胞计数;5,6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色检测不同细胞因子组合诱导CD8^(+)T细胞的增殖水平,流式细胞术检测不同细胞因子组合诱导的CD8^(+)T细胞免疫记忆表型,细胞凋亡及细胞γ干扰素(IFN-γ)、穿孔素以及颗粒酶B水平,Western blot法检测不同细胞因子组合诱导的CD8^(+)T细胞的B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)蛋白表达。结果与其他组合相比,IL-7/IL-15/IL-21/IL-23处理CD8^(+)T细胞后,促进T细胞增殖,CD62L^(+)/CD45RA^(-)的CD8^(+)中央记忆性T细胞亚群的表达显著增加。同时,IL-7/IL-15/IL-21/IL-23处理组显著降低细胞的IFN-γ、穿孔素以及颗粒酶B的分泌水平,细胞的凋亡水平也显著降低。结论IL-7/IL-15/IL-21/IL-23联合刺激有效诱导初始CD8^(+)T细胞向CD8^(+)Tcm分化,有助于优化过继免疫治疗中CD8^(+)Tcm的体外扩增策略。

肺结核患者外周血CD4^+和CD8^+记忆性T细胞亚群、IL-17、IL-27表达的初步探讨

目的:探讨肺结核患者外周血CD4+和CD8+记忆性T细胞亚群及白细胞介素17(Interleukin-17,IL-17),IL-27的表达。方法:采用流式细胞术检测肺结核患者组外周血CD4+和CD8+记忆性T细胞,患者组按治疗史分为初治组,复治组;按痰涂片抗酸染色分为痰涂阳性组,痰涂阴性组。初治组8例为凡既往未用过抗结核药物治疗或用药时间少于一个月的新发病例;复治组22例为凡既往应用抗结核药物一个月以上的新发病例、复发病例、初治治疗失败病例等;痰涂阳组9例为痰涂片抗酸染色阳性;痰涂阴组21例为痰涂片抗酸染色阴性。ELISA法检测IL-17,IL-27。结果:①与健康对照组比较:患者组CD4+效应型记忆性T细胞均显著增高(P<0.05),初治组与涂阴组CD8+效应型记忆性T细胞均显著降低(P<0.05),复治组IL-17显著降低(P<0.05),而IL-27显著增高(P<0.05)。②与初治组比较:复治组CD4+中央型记忆性T细胞显著降低(P<0.05),而CD8+效应型记忆性T细胞显著增高(P<0.05),IL-17显著降低(P<0.05),IL-27显著增高(P<0.05)。③与涂阴组比较:涂阳组CD4+中央型记忆性T细胞显著降低(P<0.05),CD8+效应型记忆性T细胞显著增高(P<0.05),CD8+中央型记忆性T细胞显著降低(P<0.05)。④Spearman相关性分析显示:IL-17与IL-27呈正相关(P<0.05),记忆性T细胞亚群与IL-17,IL-27水平无显著相关性(P>0.05)。结论:肺结核患者外周血CD4+效应型记忆性T细胞的表达可望作为TB初步诊断的观察指标,CD4+中央型记忆性T细胞和CD8+效应型记忆性T细胞的表达均可望作为TB患者的临床分组依据,TB外周血IL-17、IL-27水平可望用于判断TB的炎症程度。

慢性乙型肝炎患者外周血中记忆T细胞亚群分布研究

目的了解慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中CD4+、CD8+T细胞的分布,以及相应记忆细胞亚群的表达水平,为研究记忆T淋巴细胞在抗乙肝病毒感染中的作用提供基础。方法采用多色流式细胞仪检测技术,检测慢性乙肝病例和健康对照外周血单个核细胞(PBMC)中T淋巴细胞表面标志CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD62L、CCR7的表达情况。结果乙肝组CD4+、CD8+T淋巴细胞分别占外周血PBMC的(11.56±5.78)%、(13.11±6.64)%,均低于对照组,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。乙肝组和对照组外周血PBMC中,CD4+TEM的表达水平高于CD4+TCM,CD8+TEM的表达水平高于CD8+TCM,差异均有统计学意义(P值均<0.05);CD4+TEM、CD4+TCM所占CD4+Tm的比例,差异均无统计学意义(P值均>0.05);CD8+TEM、CD8+TCM所占CD8+Tm的比例差异无统计学意义(P值均>0.05)。结论慢性乙肝病例外周血PBMC中,CD4+、CD8+T淋巴细胞均减少。对照组和乙肝组外周血PBMC中,CD4+、CD8+T记忆淋巴细胞均以TEM为主。