光谱法、量热法以及分子对接研究酸枣仁皂苷A与中心蛋白的作用

目的研究酸枣仁皂苷A(jujuboside A,JuA)与八肋游仆虫中心蛋白(Euplotes octocarinatus centrin,EoCen)的相互作用。方法采用圆二色光谱(circular dichroism spectroscopy,CD)以及三维荧光光谱研究EoCen的构象变化;采用稳态荧光光谱与等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)研究JuA与EoCen作用的机制;分子对接技术模拟JuA与EoCen的结合位点。结果JuA以摩尔比1:1结合于EoCen的C端(二者反应的结合常数约为10^(5)L/mol),由ITC拟合结果可知,JuA与EoCen复合物的形成是放热的过程,熵变对自由能的贡献较小,主要由焓变驱动。EoCen与JuA结合后,构象发生变化,α-螺旋含量减少,酪氨酸残基的微环境变化,EoCen的C端不再结合蜂毒素。结论JuA主要通过范德华力与EoCen结合,从而改变EoCen的构象,抑制其与靶蛋白的结合。

光谱法、量热法以及分子对接技术研究阿霉素与中心蛋白的作用

目的:研究阿霉素(doxorubicin,DOX)与八肋游仆虫中心蛋白的N-端部分(N-terminal domain of Euplotes octocarinatus centrin,N-EoCen)的相互作用。方法:采用圆二色光谱以及三维荧光光谱法研究N-EoCen的构象变化,采用稳态荧光光谱法与等温滴定法(ITC)研究DOX与N-EoCen的作用机制,采用分子对接技术模拟DOX与N-EoCen的结合位点。结果:N-EoCen与DOX结合后,构象发生变化,α-helix含量减少。DOX以摩尔比1∶1与N-EoCen结合,结合常数约为105 L/mol。该反应为放热反应,熵变对自由能的贡献较小,反应主要由焓变驱动。结论:DOX主要通过疏水作用、范德华力以及氢键等多种作用与N-EoCen结合,从而使N-EoCen的构象发生改变。

游仆虫中心蛋白在大肠杆菌中的高效表达和多克隆抗体制备

中心蛋白是一种在微管组织中心的复制和分离中起着重要作用的蛋白质。为了进一步进行中心蛋白结构和功能的研究 ,我们克隆了单细胞真核生物游仆虫中心蛋白基因并构建了重组表达质粒pGEX 6P EoCen ,其在大肠杆菌BL2 1中经IPTG诱导后获得了大量的可溶性表达 ,融合蛋白表达水平达到了细菌总蛋白的 32 6 %。GST抗体进行Westernblotting检测结果为阳性。经GST亲和层析和superdex 75凝胶层析后得到 90 %以上电泳纯的蛋白。用纯化后的蛋白免疫大鼠产生抗血清 ,经ELISA检测抗体效价达 1∶2 5 6

八肋游仆虫中心蛋白N-端半分子与Tb^(3+),Ca^(2+)的结合(英文)

用分子生物学方法表达、纯化了游仆虫中心蛋白及N-端半分子,用铽荧光探针法、离子竞争法研究了pH7.4,0.01mol·L-1Hepes条件下中心蛋白与铽、钙的结合性质。结果表明中心蛋白有4个铽结合部位,其中2个为高亲合结合部位、2个为低亲合结合部位。具有2个低亲合结合部位的中心蛋白半分子与铽结合的条件常数是(2.13±0.10)×105L·mol-1,与钙结合的条件常数是(7.52±0.02)×102L·mol-1。

八肋游仆虫中心蛋白N端半分子Loop区首个氨基酸的作用

本文通过分子生物学方法将八肋游仆虫中心蛋白N端半分子loop区的首个氨基酸,天冬氨酸Asp37和Asp73,分别突变为带相反电荷的赖氨酸。使用铽敏化荧光、TNS疏水探针研究了八肋游仆虫中心蛋白N端半分子loop区的首个氨基酸的作用。结果表明:当中心蛋白loopⅠ区37位的天冬氨酸突变为赖氨酸后,loopⅠ丧失了金属离子结合能力,进而影响了中心蛋白依赖于金属离子的构象变化;而loopⅡ区73位的天冬氨酸突变为赖氨酸后仍保持金属离子结合能力,依赖于金属离子的构象变化减小。中心蛋白发挥大部分生物功能都依赖于金属离子,这就表明loopⅠ区37位的天冬氨酸在中心蛋白发挥生物功能时起着重要作用,是不可缺少的。在10 mmol·L-1 Hepes、pH 7.4、20 mmol·L-1 KCl条件下,八肋游仆虫中心蛋白N端半分子loopⅡ与金属离子Tb3+和Ca2+的结合常数分别为:KⅡ(Tb3+)=(8.31±0.18)×104 L·mol-1和KⅡ(Ca2+)=(0.94±0.12)×102 L·mol-1,中心蛋白N端半分子的两个金属结合部位结合能力顺序为:Ⅰ>Ⅱ。

中心蛋白研究进展

中心蛋白是一种约20kD的酸性钙结合蛋白,含4个EF手性结构。它在进化上极其保守,尤其是其EF手性结构区域。氨基端是变化最大的区域。目前还没有关于中心蛋白晶体结构的报道。中心蛋白是微管组织中心(MTOC)的主要成分,参与MTOC相关联的纤维的收缩,并在MTOC的生物合成过程中起重要作用。

杜氏盐藻光系统Ⅱ反应中心蛋白D1基因的克隆及序列分析

目的:克隆杜氏盐藻光系统Ⅱ反应中心蛋白D1(psbA)基因cDNA片段。方法:根据莱茵衣藻、稻以及普通小球藻等真核生物psbA基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用Trizol试剂提取杜氏盐藻细胞总RNA,通过RT-PCR获得杜氏盐藻psbA cDNA,PCR产物连接T载体转化大肠杆菌JM109,随机挑取数个菌落,筛选鉴定并测序,测序结果进行Blast比对分析和密码子偏爱性分析。结果:获得的cDNA片段长度为999 bp,编码333个氨基酸。其氨基酸序列与其他物种进行Blast比对,同源性分别为:衣藻89%、椭圆小球藻89%、莱茵衣藻89%、普通小球藻88%和玉米87%。psbA基因存在明显的密码子偏爱性,其(A+T)含量明显高于(G+C)含量。另外,所克隆的psbA序列编码赖氨酸残基的数量为1个。结论:所克隆的序列为杜氏盐藻psbA基因cDNA片段。

盐酸氯丙嗪对八肋游仆虫中心蛋白C端功能的抑制

通过荧光光谱分析、等温滴定量热(ITC)、圆二色谱(CD)、电泳等技术研究了盐酸氯丙嗪(CPZ)和八肋游仆虫中心蛋白C端(apoC-EoCen)的结合以及CPZ对蛋白功能的影响。结果表明,在室温下10 mmol·L^-1 Hepes溶液(pH=7.4)中,CPZ与apoC-EoCen以物质的量之比为1∶1结合,条件结合常数约为104L·mol^-1。CPZ的结合导致蛋白质的二级结构发生改变,α螺旋含量减小;对金属离子诱导中心蛋白的聚集产生了抑制作用,Tb3+敏化荧光强度也降低;阻碍了中心蛋白与着色性病干皮病C组蛋白(XPC)的结合;且影响了apoC-EoCen类核酸酶活性,导致蛋白对pBR322 DNA的切割能力下降;抑制了蛋白质的磷酸化。综合实验结果表明盐酸氯丙嗪是中心蛋白的生物功能阻断剂,对中心蛋白的功能具有良好的调控作用。

基于双十二烷基二甲基溴化铵、琼脂糖修饰电极的中心蛋白金属结合性质研究

应用热解石墨电极(pyrolytic graphite electrode,PG)、双十二烷基二甲基溴化铵(Didodecyldimethylammonium bromide,DDAB)修饰电极,以及应用琼脂糖修饰电极研究了八肋游仆虫N端中心蛋白(N-terminal ciliate Euplotes octocarinatus centrin,N-EoCen)、C端中心蛋白(C-EoCen)与Eu^(3+)结合反应的循环伏安特性.研究发现在琼脂糖修饰电极上出现了配合物Eu^(3+)-N-EoCen一对氧化还原峰,与仅有Eu^(3+)存在时相比,负向移动0.24 V.在DDAB修饰电极上出现了配合物Eu^(3+)-N-EoCen微弱的不可逆还原峰.经过计算N-EoCen,C-EoCen与Eu^(3+)结合反应的结合常数β和结合数n,显示N-EoCen与Eu^(3+)形成1∶2型分子复合物,结合常数β=1.26×10^(7) L·mol^(-1);C-EoCen与Eu^(3+)结合比为1∶2,结合常数β=1.38×10^(9) L·mol^(-1).

光谱法、量热法以及分子对接研究槲皮素与中心蛋白的相互作用

通过光谱法、等温滴定量热法(ITC)以及分子对接等技术研究了八肋游仆虫中心蛋白N端分子(N-EoCen)与槲皮素(Quercetin,Q)之间的相互作用以及Q对N-EoCen构象的影响.结果表明,在室温下Hepes(pH=7.4)缓冲溶液中,Q可以与N-EoCen以物质的量比1∶1结合于N-EoCen的第二个EF-hand的E,F螺旋之间,条件结合常数约为104L·mol^(-1),复合物的形成是放热的过程,Q与N-EoCen之间存在氢键、疏水作用以及范德华力等多种作用.Q与N-EoCen中酪氨酸残基(Tyr72)的结合距离为1.54 nm.复合物的形成使得蛋白的构象发生变化,α-helix含量减少.本文的研究成果对于进一步了解中心蛋白分子识别多样性的结构基础,以及相关药物的研发具有参考价值.

长春碱与中心蛋白的结合及其对蛋白聚集性质的影响

通过光谱、等温滴定量热(ITC)以及分子对接等方法研究了八肋游仆虫中心蛋白N-端半分子(N-EoCen)与长春碱(Vin)之间的相互作用以及Vin对N-EoCen聚集性质的影响。结果表明,Vin可以与N-EoCen以摩尔比1∶1结合于N-EoCen的第一个EF-hand的F螺旋与第二个EF-hand的E、F螺旋之间,条件结合常数约为10^(4)L/mol。复合物的形成是放热的过程,主要依靠静电作用与疏水作用。N-EoCen与Vin结合后,构象发生变化,α螺旋含量减少,N-EoCen与Tb^(3+)结合能力减弱。最终使得N-EoCen的自聚集以及Tb^(3+)诱导的聚集减弱。研究结果为蛋白聚集抑制剂的筛选以及相关药物的研发提供了参考和依据。

TNS探针检测中心蛋白与DNA结合后的构象变化

中心蛋白(centrin)通过构象变化吸引多种修复因子到DNA损伤位点,参与核苷酸切除修复的识别过程,利用荧光探针可以研究蛋白质的构象变化。本研究以2-对甲苯胺基-6-萘磺酸(TNS)为探针,应用光谱法探究了八肋游仆虫中心蛋白N-端半分子(N-EoCen)与小牛胸腺DNA(CT-DNA)作用后的构象变化。结果表明,N-EoCen可以与CT-DNA形成复合物,复合物的形成使得蛋白的构象发生变化,疏水腔暴露。Ca^(2+)与N-EoCen配位后,有利于N-EoCen与CT-DNA的结合,会进一步诱导蛋白中疏水性氨基酸残基的暴露。本文研究结果为今后研究中心蛋白在核苷酸切除修复的识别过程中的分子机制提供了理论基础,并且为TNS作为探针应用于检测蛋白质与其他生物大分子的作用提供了参考。

中心体相关蛋白55、睾丸表达基因14在结直肠癌组织中表达及其临床意义

目的回顾性分析中心体相关蛋白55(CEP55)、睾丸表达基因14(TEX14)在结直肠癌组织中表达及其临床意义。方法选取2015年10月至2016年10月在南阳市中心医院行手术治疗的78例结直肠癌病人癌组织及其癌旁组织为研究对象。利用Ualcan数据库分析CEP55和TEX14在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测CEP55和TEX14 mRNA表达;免疫组化染色法检测CEP55和TEX14蛋白表达;分析CEP55和TEX14蛋白表达与病人临床病理特征的关系;对病人随访5年,使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析CEP55和TEX14蛋白表达与结直肠癌病人5年生存率的关系;使用Cox回归模型分析影响结直肠癌病人预后的因素。结果Ualcan数据库分析结果显示,结直肠癌组织中CEP55和TEX14表达量均明显高于癌旁组织(P<0.05)。结直肠癌组织中CEP55、TEX14 mRNA水平(2.34±0.70比1.00±0.26、1.57±0.44比0.98±0.25)及蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织(P<0.05)。CEP55和TEX14蛋白表达与分化类型、有无淋巴结转移、TNM分期、有无神经浸润、有无肝转移有关(P<0.05)。结直肠癌组织中CEP55蛋白阳性病人生存率为52.73%,明显低于CEP55蛋白阴性病人生存率78.26%(P<0.05);TEX14蛋白阳性病人生存率为52.63%,明显低于TEX14蛋白阴性病人生存率80.95%(P<0.05)。低分化、淋巴结转移、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、CEP55蛋白阳性、TEX14蛋白阳性是影响结直肠癌病人5年预后的独立危险因素(P<0.05)。结论CEP55和TEX14在结直肠癌组织中呈高表达,CEP55和TEX14蛋白阳性病人5年生存率低于阴性病人,这些指标的临床意义,值得进一步研究。

老年原发性肝癌患者癌组织中FoxO1、SREBP2及中心体蛋白55表达特点及意义

目的探讨老年原发性肝癌患者癌组织中叉头转录因子O家族(FoxO)1、胆固醇调节原件结合蛋白(SREBP)2及中心体蛋白55表达特点及意义。方法选取老年原发性肝癌患者75例,收集患者性别、年龄、肝硬化情况、肿瘤直径、分化程度、肿瘤数量、病理类型、TNM分期情况、门静脉侵袭情况;术中采集肝癌组织标本和距离肝癌病灶边缘约5 cm的癌旁正常组织标本,免疫组化法检测FoxO1、SREBP2及中心体蛋白55表达。出院后进行3年随访,记录患者生存情况。结果肝癌组织中FoxO1蛋白阳性率明显低于癌旁组织,SREBP2蛋白、中心体蛋白55阳性率明显高于癌旁组织(P<0.01)。FoxO1蛋白、SREBP2蛋白、中心体蛋白55阳性率在不同肿瘤直径、分化程度、肿瘤数量、病理类型、TNM分期、门静脉侵袭的老年原发性肝癌患者间比较差异有统计学意义(P<0.01)。FoxO1阴性者3年生存率明显高于FoxO1阳性者(P<0.01);SREBP2、中心体蛋白55阳性者3年生存率明显高于SREBP2、中心体蛋白55阴性者(P<0.01)。受试者工作特征(ROC)曲线分析显示,FoxO1、SREBP2、中心体蛋白55单独和联合检测对老年原发性肝癌患者3年生存情况具有较高的预测价值(P<0.05);其中联合检测的预测价值最高,灵敏度、阳性预测值明显高于各指标单独检测。结论老年原发性肝癌患者癌组织中FoxO1低表达,SREBP2及中心体蛋白55高表达,与临床病理特征及预后相关,联合检测可用于预后评估。

中心粒周蛋白在牙颌面及相关发育畸形中的作用及机制研究进展

中心粒周蛋白(pericentrin,PCNT)是一种中心体周围蛋白,在有丝分裂、减数分裂等多个生物学行为中发挥着重要作用。PCNT突变可导致多种牙颌面部畸形,包括严重颅颌面骨发育畸形和牙发育异常。虽然临床症状多有报道,但是PCNT在口腔领域的相关研究还十分有限。为了更好理解PCNT相关颅颌面畸形的临床表现及发病机制,本文综述了近年来发表的PCNT的功能和致病机制相关的研究进展,为以后开展PCNT在牙-牙周组织及颅颌面骨发育中的功能研究提供参考。

生发中心相关核蛋白研究进展

生发中心相关核蛋白(germinal center-associated nuclear protein,GANP)是一种小分子的编码蛋白,参与构成mRNA输出支架蛋白、影响mRNA核输出、调节DNA的修复、保护细胞延缓衰老、促进B细胞活化、产生高亲和力抗体等一系列生物学过程,涉及细胞生长调控、免疫系统活化及肿瘤调控等领域,影响着人类的健康。

盐酸胍诱导八肋游仆虫中心蛋白与XPC肽复合物的解折叠

为探索真核生物核苷酸切除修复的可能性,选择人着色性干皮病(XPC)包含中心蛋白结合的多肽为研究对象,采用圆二色谱(CD)、荧光光谱与等温滴定量热法(ITC)对八肋游仆虫中心蛋白(EoCen)的靶肽结合进行了构象与热力学表征.结果表明C端结构域是XPC结合的关键位点,XPC发生构象变化由无规则状态转变为α-螺旋,色氨酸残基镶嵌在C端EF-手形成的疏水腔中,靶肽识别是放热反应,焓变对吉布斯自由能的贡献很大.盐酸胍诱导EoCen-XPC复合物的解折叠机理,并不是使复合物解离,而是使容纳XPC的C端疏水腔瓦解,XPC游离出来.

八肋游仆虫中心蛋白的核磁共振研究

利用液体核磁共振方法对八肋游仆虫中心蛋白全长蛋白(EoCen),LC端结构域(EoCen-LC)和N端结构域(EoCen-N)进行了分析,并研究了蛋白与钙离子的相互作用情况.研究结果表明,未加入钙离子,全长蛋白,LC端结构域和N端结构域谱图重叠严重,峰型较差,说明未折叠成良好的三级结构,存在较大的构象交换或一定程度的聚集;与钙离子结合后全长蛋白,LC端结构域三级结构有所改善,但仍然无法用液体核磁共振方法进行进一步的结构研究.N端结构域与钙离子结合后谱峰分散性好,说明N端结构域具有较好的三级结构,能够应用核磁共振的方法进行结构解析.

稀土离子(Ho,Er,Yb)与八肋游仆游虫中心蛋白N端半分子作用的光谱研究

在0.01 mol·L-1Hepes,0.15 mol·L-1Na Cl,p H 7.4及室温条件下,采用紫外差光谱和荧光光谱的方法研究了稀土离子Ho(III),Er(III),Yb(III)与八肋游仆虫中心蛋白N端半分子(N-terminal domain of Euplotes octocarinatus centrin,N-Eo Cen)的结合性质。结果表明:稀土离子Ho(III),Er(III),Yb(III)与N-Eo Cen结合导致蛋白质高级结构发生明显变化,疏水区暴露增加。二甲酚橙为竞争配体测得稀土离子Ho(III),Er(III),Yb(III)与N-Eo Cen两个位点的结合能力分别为:lg KI,Ho(III)=5.47±0.37,lg KII,Ho(III)=5.07±0.45;lg KI,Er(III)=5.78±0.42,lg KII,Er(III)=5.36±0.52;lg KI,Yb(III)=5.80±0.65,lg KII,Yb(III)=5.37±0.61。

中心蛋白C端半分子与Sm^(3+)作用的光谱研究

在0.01 mol.L-1Hepes,0.15 mol.L-1NaCl,pH 7.4及室温条件下,通过荧光光谱、圆二色光谱和紫外差光谱的方法研究了Sm3+与八肋游仆虫中心蛋白C端半分子(C-terminal domain of Euplotes octocarinatus centrin,C-EoCen)III,IV结合位点的结合能力及结合后对蛋白质构象的影响。结果表明,Sm3+与C-EoCen结合后,蛋白质从关闭式构象转变为开放式构象,蛋白的疏水性结构域外露程度增强,同时蛋白的α-螺旋含量明显增大;Sm3+与C-EoCen的III,IV结合位点的条件稳定常数分别为:lgKIII=6.23±0.39,lgKIV=6.81±0.51。